Studier av Chaperone-Cochaperone interaksjoner ved hjelp av homogen perlebasert analyse

Summary

Denne protokollen presenterer en teknikk for å undersøke proteinproteininteraksjoner ved hjelp av glutathione-tilknyttede donorperler med GST-smeltet TPR-motiv co-chaperones og akseptorperler kombinert med et Hsp90-avledet peptid. Vi har brukt denne teknikken til å screene små molekyler for å forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaksjoner og identifisert potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaksjonshemmere.

Abstract

Målretting av varmesjokkproteinet 90 (Hsp90)-cochaperone interaksjoner gir mulighet til å spesifikt regulere Hsp90-avhengige intracellulære prosesser. Den konserverte MEEVD pentapeptide på C-terminus av Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptide repeat (TPR) motiv av co-chaperones. FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er to lignende TPR-motiv co-chaperones involvert i steroidhormonavhengige sykdommer med forskjellige funksjoner. Derfor gir identifisering av molekyler som spesifikt blokkerer interaksjoner mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52 et lovende terapeutisk potensial for flere menneskelige sykdommer. Her beskriver vi protokollen for en forsterket luminescerende nærhet homogen analyse for å sondere interaksjoner mellom Hsp90 og partnerkollegaene FKBP51 og FKBP52. For det første har vi renset TPR-motivholdige proteiner FKBP51 og FKBP52 i glutathione S-transferase (GST)-merket form. Ved hjelp av glutathione-tilknyttede donorperler med GST-smeltet TPR-motivproteiner og akseptorperler kombinert med et 10-mer C-terminal peptid av Hsp90, har vi undersøkt proteinproteininteraksjoner i et homogent miljø. Vi har brukt denne analysen til å screene små molekyler for å forstyrre Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaksjoner og identifisert potente og selektive Hsp90-FKBP51 interaksjonshemmere.

Introduction

Molekylære anstander bidrar til protein homeostase, inkludert proteinfolding, transport og nedbrytning. De regulerer flere cellulære prosesser og er knyttet til mange sykdommer som kreft og nevrodegenerative sykdommer¹. Varmesjokkprotein 90 (Hsp90) er en av de viktigste anstandene hvis funksjon er avhengig av konformasjonsendringer drevet av ATP hydrolyse og binding med klientproteiner mediert av sine medprester². Til tross for et åpenbart potensial for Hsp90 som terapeutisk mål, representerer finjustering av funksjonen en stor utfordring. Det er flere Hsp90-hemmere rettet mot N-terminal ATP-bindingsregionen, som har blitt evaluert i kliniske studier, men ingen av dem er godkjent for markedsføring³. På grunn av mangelen på en veldefinert ligandbindingslomme⁴, har målretting av C-terminalområdet Hsp90 hatt begrenset suksess⁴. Nylig har forstyrrelse av Hsp90-cochaperone interaksjoner av små molekyler blitt undersøkt som en alternativ strategi⁵. Målretting av Hsp90-cochaperone interaksjoner ville ikke fremkalle generell celle stress respons og gir mulighet til å spesifikt regulere ulike intracellulære prosesser. Den konserverte MEEVD pentapeptide på C-terminus av Hsp90 er ansvarlig for samspillet med tetratricopeptide repeat (TPR) motiv av co-chaperones⁶. Av de 736 TPR-motivholdige proteinene som er kommentert i den menneskelige proteindatabasen, samhandler ~ 20 forskjellige proteiner med Hsp90 via dette^{peptidet 7}. Molekyler som konkurrerer om MEEVD peptidbinding vil forstyrre interaksjonene mellom Hsp90 og medprester som inneholder et TPR-domene. Peptidbindingsstedet har lignende tertiær struktur, men den generelle homologien mellom forskjellige TPR-motivdomener er relativt lav⁷, noe som gir en mulighet til å identifisere molekyler som er spesielt i stand til å blokkere interaksjoner mellom Hsp90 og spesielle TPR-motiv co-chaperones. Blant disse TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindende protein (FKBP) 51 og FKBP52 er regulatorer av steroid hormon reseptor (SHR) signalering og involvert i flere steroidhormonavhengige sykdommer inkludert kreft, stress-relaterte sykdommer, metabolske sykdommer, og Alzheimers sykdom⁸. Selv om FKBP51 og FKBP52 deler > 80% sekvenslikhet, varierer deres funksjoner: FKBP52 er en positiv regulator for SHR-aktivitet, mens FKBP51 er en negativ regulator i de fleste tilfeller⁸. Derfor gir identifisering av molekyler, spesielt blokkering av interaksjoner mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52, et lovende terapeutisk potensial for relaterte sykdommer.

Enmplified Luminescent Proximity Homogen Assay (AlphaScreen) ble først utviklet i 1994 av Ullman EF et al.⁹. Nå er det mye brukt til å oppdage forskjellige typer biologiske interaksjoner, for eksempel peptid¹⁰, protein¹¹, DNA¹², RNA¹³og sukker¹⁴. I denne teknikken er det to typer perler (diameter 200 nm), den ene er donorperlen og den andre er akseptorperlen. Biomolekylene er immobilisert på disse perlene; deres biologiske interaksjoner bringer donor- og akseptorperler i nærheten. Ved 680 nm lyser en fotosensibilisator i donorperlen og konverterer oksygen til singlet oksygen. Fordi singlet oksygen har kort levetid, kan det bare diffusere opptil 200 nm. Hvis akseptorperlen er i nærheten, reagerer dets tioksenderivat med singlet oksygengenererende chemiluminescens ved 370 nm. Denne energien aktiverer videre fluoroforer i samme akseptorperle for å avgi lys ved 520-620 nm¹⁵. Hvis de biologiske interaksjonene blir forstyrret, kan ikke akseptorperlen og donorperlen nå nærhet, noe som resulterer i singlet oksygenforfall og lavt produsert signal.

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av denne teknikken for screening av små molekyler som hemmer interaksjoner mellom Hsp90 og TPR co-chaperones, spesielt FKBP51 og FKBP52. De 10 aminosyre lange peptidene som tilsvarer Hsp90 ekstrem C-terminus er festet til akseptorperler. Renset GST-merket TPR co-chaperones samhandler med glutathione-tilknyttede donorperler. Når samspillet mellom Hsp90-avledede peptider og TPR-motiv co-chaperones bringer perlene sammen, produseres et forsterket signal (Figur 1A). Hvis de screenede små molekylene kan hemme interaksjonene mellom Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, vil dette forsterkede signalet bli redusert (Figur 1B). Deres IC₅₀ kan beregnes ved kvantitativ måling. Denne protokollen kan utvides til enhver anstand – TPR-motiv co-chaperone interaksjoner av interesse og er av stor betydning i utviklingen av nye molekyler, spesielt blokkerer samspillet mellom Hsp90 og FKBP51 eller FKBP52.

Figur 1: Det grunnleggende prinsippet i denne analysen. (A) Renset GST-FKBP51 samhandler med glutathione-tilknyttede donorperler. De 10 aminosyre lange peptidene som tilsvarer den ekstreme C-terminus av Hsp90 er festet til akseptorperler. Samspillet mellom Hsp90-avledede peptider og TPR-domenet til FKBP51 bringer donor- og akseptorperlene i nærheten. Ved 680 nm lyser en fotosensibilisator i donorperlen og konverterer oksygen til singlet oksygen. Tioksenderivatet på akseptorperlen reagerer med singlet oksygen og genererer chemiluminescens ved 370 nm. Denne energien aktiverer videre fluoroforer i samme akseptorperle for å avgi lys ved 520-620 nm. (B) Når små molekyler hemmer interaksjonene mellom Hsp90 og FKBP51, kan donor- og akseptorperler ikke nå nærhet. Deretter forfaller singlet oksygen med kort levetid, og det produseres ikke noe påviselig signal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

MERK: En oversikt over denne protokollen vises i figur 2. 1. Uttrykk og rensing av GST-FKBP51 og GST-FKBP52 (Figur 2A) PlasmiderMERK: Få cDNA-kloner for humant FKBP51 (klone-ID: 5723416) og for humant FKBP52 (klone-ID: 7474554) fra IMAGE-konsortiet. Forsterk det menneskelige FKBP51 DNA av PCR med primere (fremover; 5’GGATCCATGACTGATGAAGGT-3′, omvendt; 5′-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3′) som innehol…

Representative Results

I vår analyse er Z’faktor og S/B-forholdet henholdsvis 0,82 og 13,35 (figur 3A), noe som viser at analysen vår er robust og pålitelig for screening med høy gjennomstrømning. Vi brukte den deretter til å screene små molekylære masseforbindelser. Figur 3B presenterer doseavhengig hemming av chaperone-cochaperone interaksjoner med et valgt lite molekyl (D10). Doseresponskurvene for D10 genereres ved ikke-lineær regresjonsanalyse, basert på hvilke verdiene…

Discussion

Her beskriver vi en protokoll ved hjelp av analysen for screening av små molekyler som hemmer interaksjoner mellom Hsp90 og TPR-motiv co-chaperones, spesielt FKBP51 og FKBP52. Den høye Z-poengsummen (>0,8) demonstrerer robustheten og påliteligheten for et format med høy gjennomstrømning. Resultatene kan oppnås innen en time, og små mengder perler, protein og forbindelser er nødvendig. Videre kan denne protokollen enkelt utvides til enhver Hsp90 / Hsp70 – TPR-motiv co-chaperone interaksjoner av interesse. Flere TP…

Materials

384-well plates	Perkin Elmer	6008350	Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit	Millipore	UFC901008	Concentrate protein
Ampicillin	Sigma	A0166	Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010	Heidolph		Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51	Source BioScience	clone id: 5723416	pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52	Source BioScience	clone id: 7474554	pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C602003	One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software	GraphPad Prism	9.0.0	Analysis data and make figures
Data analysis software	Excel		Analysis data
DMSO	Supelco	1.02952.1000	Dilute compounds
DPBS	Gibco	14190-144	Prepare solution
EDTA	Calbiochem	344504	Prevent proteolysis during sonication
Glutathione	Sigma	G-4251	Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads	Perkin Elmer	6765300	Donor bead
GST-trap column	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside	Thermo Fisher Scientific	R0392	Induce protein expression
LB Broth (Miller)	Sigma	L3522	Microbial growth medium
PCR instrument	BIO-RAD	S1000 Thermal Cycler	Amplification/PCR
PD-10 column	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Solution exchange
pGEX-6P-1 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	Plasmid
pGEX-6P-2 vector	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	Plasmid
Plate reader	Perkin Elmer	EnSpire 2300 Multilabel Reader	Read alpha plate
Plate reader software	Perkin Elmer	EnSpire Manager	Plate reader software
Plate reader software protocol	Perkin Elmer	Alpha 384-well Low volume	Use this protocol to read plate
PMSF	Sigma	P7626	Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail	Sigma	S8830	Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide	Sigma	S2002	As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN)	Sigma	156159	Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform	Peptide 2.0 inc		Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator	LABINCO		Make end-over-end agitation
Tris-HCl	Sigma	10708976001	Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20	Sigma	P1379	Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor	Microson		Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads	Perkin Elmer	6762003	Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module	Invitrogen	EI0002	SDS-PAGE