Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen
Summary
Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.
Abstract
Die Identifizierung neu auftretender bakterieller Krankheitserreger ist für die menschliche Gesundheit und Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Die bakterielle Adhärenz an wirtszellen ist ein wesentlicher Schritt bei bakteriellen Infektionen und stellt ein Kennzeichen potenzieller Bedrohung dar. Daher kann die Untersuchung der Adhärenz von Bakterien an Wirtszellen als Bestandteil der bakteriellen Bedrohungsbewertung verwendet werden. Eine Standardmethode zur Aufzählung der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen besteht darin, Bakterien mit Wirtszellen zu inkubieren, die adhärenten Bakterien zu ernten, die geernteten Zellen auf festen Medien zu plattieren und dann die resultierenden koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Alternativ kann die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen bewertet werden. Herkömmliche Strategien zur Umsetzung dieser Ansätze sind jedoch zeitaufwendig und ineffizient. Hier wird ein kürzlich entwickeltes automatisiertes fluoreszenzmikroskopiebasiertes Bildgebungsverfahren beschrieben. In Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse ermöglicht die Methode eine schnelle Quantifizierung von Bakterien, die an Wirtszellen haften. Zwei Bakterienarten, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa und Gram-positive Listeria monocytogenes und entsprechende Negativkontrollen, wurden getestet, um das Protokoll zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz adhärente Bakterien schnell und genau aufzählt und experimentelle Arbeitsbelastungen und Zeitpläne signifikant reduziert.
Introduction
Bakterielle Adhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Bakterien an andere Zellen oder Oberflächen anlagern. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion durch bakterielle Krankheitserreger erfordert die Adhäsion an Wirtszellen, die Besiedlung von Geweben und in einigen Fällen die Invasion von Wirtszellen1,2,3. Neu auftretende Infektionskrankheiten stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, wie die jüngste COVID-19-Pandemie4,5,6 zeigt. Wichtig ist, dass neue oder aufkommende Krankheitserreger mit genombasierten Ansätzen möglicherweise nicht ohne weiteres erkannt werden können, insbesondere in Fällen, in denen der Erreger so konstruiert wurde, dass er sich dem Nachweis entzieht oder keine genomischen Signaturen enthält, die ihn als pathogen identifizieren. Daher kann die Identifizierung potenzieller Krankheitserreger mit Methoden, die Kennzeichen der Pathogenität, wie die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen, direkt bewerten, eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Krankheitserregern spielen.
Bakterielle Adhärenz an Wirtszellen wird seit Jahrzehnten verwendet, um Mechanismen der bakteriellen Pathogenese zu bewerten1,7. Die mikroskopische Bildgebung8,9 und die Aufzählung der bakteriellen koloniebildenden Einheit (KBE)10 , 11,12,13 durch Post-Infektionsplattierung sind zwei gut entwickelte Labormethoden zur Prüfung der mikrobiellen Adhärenz und/oder Infektion von Wirtszellen14. In Anbetracht der Mikrometerskala von Bakterienzellen erfordert die Zählung der adhärenten Bakterienzellen im Allgemeinen den Einsatz fortschrittlicher Mikroskopietechniken mit hoher Vergrößerung sowie hochauflösender Bildgebungsansätze, einschließlich Elektronenmikroskopie, Expansionsmikroskopie (ExM)15,16und dreidimensionale Bildgebung17 . Alternativ kann die Zählung von Bakterien, die an Wirtszellen gebunden oder internalisiert sind, durchgeführt werden, indem die Verdünnungsreihe der geernteten Bakterien auf festes Agar plattiert und die resultierenden CFUs10,12,13gezählt werden. Diese Methode ist mühsam und umfasst viele manuelle Schritte, was Schwierigkeiten bei der Etablierung eines standardisierten oder automatisierten Verfahrens mit sich bringt, das für Hochdurchsatzanalysen erforderlich ist18,19. Daher würde die Entwicklung neuer Methoden zur Bewertung der Wirtszellbindung die derzeitigen Einschränkungen in diesem Bereich angehen.
Eine solche Methode wird hier beschrieben, die automatisierte Hochdurchsatzmikroskopie in Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse verwendet. Um den Ansatz zu demonstrieren, wurden Experimente mit mehreren bakteriellen Krankheitserregern durchgeführt, darunter Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger von Menschen, Tieren und Pflanzen14,20, der häufig die Atemwege von Patienten mit beeinträchtigten Wirtsabwehrfunktionen besiedelt. Dieser Ansatz optimierte den in früheren Studien14,20beschriebenen mikroskopischen Bildgebungsprozess. Der bildgebende Nachweis wurde durch fluoreszenzmarkierte Wirtszellen und Bakterien vereinfacht, um die Nähe von ihnen schnell zu verfolgen, was den Mikroskopieaufwand drastisch reduzierte, um hochauflösende Bilder zur Unterscheidung von Bakterien zu erhalten. Darüber hinaus ersetzte die automatisierte statistische Analyse von Bildern in zählenden Wirtszellen und Bakterien das praktische Experiment der bakteriellen CFU-Beschichtung, um das Verhältnis der adhärenten Bakterienzahlen pro Wirtszelle abzuschätzen. Um die Kompatibilität dieser Methode zu bestätigen, wurden auch mehrere Bakterienstämme und Wirtszelltypen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae sowie menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) getestet, und die Ergebnisse unterstützen die Vielfalt und Wirksamkeit der Methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Aufzählung der bakteriellen Bindung an Wirtszellen. Der beschriebene Ansatz hat mehrere attraktive Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden. Erstens ermöglicht dieser Ansatz die genaue Quantifizierung der Anzahl der mikrobiellen Pathogenzellen, die an einzelne Wirtszellen gebunden sind. Wichtig ist, dass diese Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Bakterienernte, seriellen Verdünnung, Beschichtung auf festen Medien und Bestimmung der CFUs<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Kaite Zlotkowski von Biotek Inc. für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium unter der Vertragsnummer W911NF1920013 an PdF, die Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) und das Innenministerium unter der Vertragsnummer 140D6319C0029 an PdF unterstützt. Der Inhalt der Informationen spiegelt nicht unbedingt die Position oder die Politik der Regierung wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
Referências
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