Detección automatizada y de alto rendimiento de la adherencia bacteriana a las células huésped
Summary
La detección de interacciones entre el patógeno bacteriano huésped basada en la adherencia fenotípica utilizando imágenes de etiquetado de fluorescencia de alto rendimiento junto con métodos de análisis estadístico automatizados permite una evaluación rápida de las posibles interacciones bacterianas con las células huésped.
Abstract
La identificación de patógenos bacterianos emergentes es fundamental para la salud y la seguridad humanas. La adherencia bacteriana a las células huésped es un paso esencial en las infecciones bacterianas y constituye un sello distintivo de amenaza potencial. Por lo tanto, el examen de la adherencia de las bacterias a las células huésped se puede utilizar como un componente de la evaluación de la amenaza bacteriana. Un método estándar para enumerar la adherencia bacteriana a las células huésped es co-incubar bacterias con células huésped, cosechar las bacterias adherentes, colocar las células cosechadas en medios sólidos y luego contar las unidades formadoras de colonias (UFC) resultantes. Alternativamente, la adherencia bacteriana a las células huésped se puede evaluar utilizando enfoques basados en microscopía de inmunofluorescencia. Sin embargo, las estrategias convencionales para implementar estos enfoques consumen mucho tiempo y son ineficientes. Aquí, se describe un método de imágenes basado en microscopía de fluorescencia automatizada recientemente desarrollado. Cuando se combina con el procesamiento de imágenes de alto rendimiento y el análisis estadístico, el método permite una cuantificación rápida de las bacterias que se adhieren a las células huésped. Se probaron dos especies bacterianas, Pseudomonas aeruginosa Gram-negativa y Listeria monocytogenes Gram-positiva y los controles negativos correspondientes, para demostrar el protocolo. Los resultados muestran que este enfoque enumera de forma rápida y precisa las bacterias adherentes y reduce significativamente las cargas de trabajo y los plazos experimentales.
Introduction
La adhesión bacteriana es un proceso por el cual las bacterias se adhieren a otras células o superficies. El establecimiento exitoso de la infección por patógenos bacterianos requiere adhesión a las células huésped, colonización de los tejidos y, en algunos casos, invasión de las células huésped1,2,3. Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen importantes amenazas para la salud pública, como lo demuestra la reciente pandemia de COVID-194,5,6. Es importante destacar que los patógenos nuevos o emergentes pueden no discernirse fácilmente utilizando enfoques basados en la genómica, especialmente en los casos en que el patógeno ha sido diseñado para evadir la detección o no contiene firmas genómicas que lo identifiquen como patógeno. Por lo tanto, la identificación de patógenos potenciales utilizando métodos que evalúan directamente las características distintivas de la patogenicidad, como la adherencia bacteriana a las células huésped, puede desempeñar un papel crítico en la identificación de patógenos.
La adherencia bacteriana a las células huésped se ha utilizado para evaluar los mecanismos de patogénesis bacteriana durante décadas1,7. Las imágenes microscópicas8,9 y la enumeración de la unidad formadora de colonias bacterianas (UFC)10,11,12,13 por recubrimiento posterior a la infección son dos métodos de laboratorio bien desarrollados para probar la adherencia microbiana y / o la infección de las células huésped14. Teniendo en cuenta el tamaño de escala micrométrica de las células bacterianas, la enumeración de las células bacterianas adherentes generalmente requiere el uso de técnicas avanzadas de microscopía de alto aumento, así como enfoques de imágenes de alta resolución, incluida la microscopía electrónica, la microscopía de expansión (ExM)15,16y las imágenes tridimensionales17 . Alternativamente, la enumeración de bacterias unidas o internalizadas dentro de las células huésped se puede realizar enchapando la serie de dilución de bacterias cosechadas en agar sólido y contando las UFC resultantes10,12,13. Este método es laborioso e incluye muchos pasos manuales, lo que introduce dificultades para establecer un procedimiento estandarizado o automatizado requerido para los análisis de alto rendimiento18,19. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos métodos para evaluar la conexión de la célula huésped abordaría las limitaciones actuales en el campo.
Aquí se describe uno de estos métodos que utiliza microscopía automatizada de alto rendimiento, combinada con procesamiento de imágenes de alto rendimiento y análisis estadístico. Para demostrar el enfoque, se realizaron experimentos con varios patógenos bacterianos, incluido Pseudomonas aeruginosa,un patógeno bacteriano Gram-negativo oportunista de humanos, animales y plantas14,20, que con frecuencia se encuentra colonizando el tracto respiratorio de pacientes con funciones de defensa del huésped deterioradas. Este enfoque optimizó el proceso de imagen microscópica descrito en estudios previos14,20. La detección por imágenes se simplificó mediante células huésped y bacterias marcadas con fluorescencia para rastrear rápidamente la proximidad de ellas, lo que redujo drásticamente la carga de trabajo de microscopía para obtener imágenes de alta resolución para distinguir bacterias. Además, el análisis estadístico automatizado de imágenes en el conteo de células huésped y bacterias reemplazó el experimento práctico de recubrimiento de UFC bacteriana para estimar la proporción de recuentos bacterianos adherentes por célula huésped. Para confirmar la compatibilidad de este método, también se han probado múltiples cepas bacterianas y tipos de células huésped, como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Klebsiella pneumoniae, así como células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC), y los resultados respaldan la diversidad y efectividad del método.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo describe un enfoque automatizado para enumerar la unión bacteriana a las células huésped. El enfoque descrito tiene varias ventajas atractivas sobre los métodos convencionales. En primer lugar, este enfoque permite la cuantificación precisa del número de células patógenas microbianas que están unidas a células huésped individuales. Es importante destacar que esta cuantificación se puede realizar sin la necesidad de una laboriosa recolección bacteriana, diluciones en serie, recubrimiento en medio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a la Dra. Kaite Zlotkowski de Biotek Inc. por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa bajo el número de contrato W911NF1920013 a PdF, la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) y el Departamento del Interior bajo el Contrato No. 140D6319C0029 a PdF. El contenido de la información no refleja necesariamente la posición o la política del Gobierno, y no debe inferirse ningún respaldo oficial.
Materials
| 10x PBS | VWR | 45001-130 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher | 62248 | Host cell staining dye |
| 96 well plate | Corning | 3882 | Half area well, flat clear bottom |
| A549 cells | ATCC | CCL 185 | Mammalian cell line |
| BactoView Live Red | Biotium | 40101 | Bacteria staning dye |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE cell division tracker | BioLegend | 423801 | |
| Cytation 5 | BioTek | Cytation 5 | Cell imaging multi-mode reader |
| E. coli | Laboratory stock | ||
| EGM bulletKit | Lonza | CC-3124 | HUVEC cell culture medium |
| EHEC | NIST collections | ||
| F-12k medium | ATCC | 302004 | A549 cell culture medium |
| Fetal bovine serum | Corning | 35-016-CV | |
| HUVEC | Laboratory stock | ||
| L. monocytogenes | NIST collections | ||
| OD600 DiluPhotometer | IMPLEN | ||
| P. aeruginosa | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| P. aeruginosa ΔpilA | Dr. Lori Burrows laboratory stock | ||
| S. agalactiae | NIST collections | ||
| S. aureus | BEI | NR-46543 | |
| S. aureus ΔsaeR | BEI | NR-48164 | |
| S. rubidaea | NIST collections | ||
| Typical soy broth | Growcells | MBPE-4040 |
Referências
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