Manuelles Blot-and-Plunge-Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie
Summary
Dieses Manuskript skizziert die Blot-and-Plunge-Methode zum manuellen Einfrieren biologischer Proben für die kryogene Elektronenmikroskopie mit einem Partikel.
Abstract
Die Abbildung biologischer Proben mit Elektronen zur hochauflösenden Strukturbestimmung durch kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) erfordert eine dünne Schicht Glaseis, die die interessierenden Biomoleküle enthält. Trotz zahlreicher technologischer Fortschritte in den letzten Jahren, die die Einzelpartikel-KryoEM an die Spitze der Strukturbiologie gebracht haben, bleiben die Methoden, mit denen Proben für die hochauflösende Bildgebung verglast werden, oft der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt. Obwohl zahlreiche neuere Bemühungen Mittel zur Überwindung von Hürden bereitgestellt haben, die häufig bei der Probenverglasung auftreten, einschließlich der Entwicklung neuartiger Probenträger und innovativer Vitrifikationsinstrumente, bleibt der traditionelle manuell betriebene Kolben aufgrund der niedrigen Anschaffungskosten und der einfachen Bedienung ein Grundnahrungsmittel in der KryoEM-Community. Hier stellen wir detaillierte Methoden für den Einsatz eines standardmäßigen, guillotinenartigen, manuell betriebenen Blot-and-Plunge-Geräts zur Vitrifikation biologischer Proben für die hochauflösende Bildgebung mittels Einzelpartikel-KryoEM zur Verfügung. Darüber hinaus werden häufig auftretende Probleme und Empfehlungen zur Fehlerbehebung für den Fall beschrieben, dass ein Standardpräparat keine geeignete Probe liefert.
Introduction
Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine leistungsstarke Strukturtechnik, mit der Strukturen dynamischer biologischer Proben mit nahezu atomarer Auflösung gelöst werden können1,2,3,4. In der Tat, jüngste Fortschritte in der direkten Elektronendetektortechnologien4,5,6,7,8,9,10, Verbesserungen der Elektronenquellen4,11,12,13,14 und elektromagnetische Linsenstabilität15, gepaart mit der kontinuierlichen Entwicklung der Datenerfassung 16,17 und Analysesoftwarepakete18,19 haben es den Forschern ermöglicht, strukturen von gut erzogenen Proben mit einer Auflösung von 3 Å oder besser routinemäßig zu bestimmen4,11,13,14,20,21,22,23 . Trotz dieser verbesserten Bildgebungs- und Datenverarbeitungsfunktionen bleibt die KryoEM-Netzvorbereitung das größte Hindernis für eine erfolgreiche hochauflösende Strukturbestimmung und stellt oft einen erheblichen Engpass im EM-Workflow dar24,25,26,27.
CryoEM beruht auf der Bildgebung biologischer Proben in wässrigen Lösungen, die eingefroren werden, um einen dünnen Film aus “glasartigem” Eis zu bilden – ein Prozess, der als Vitrifikation bekannt ist -, der den nativen biochemischen Zustand bewahrt. Die Vitrifikation biologischer Proben für KryoEM reicht über 40 Jahre zurück28,29,30 und viele Techniken und Geräte, die für diesen Prozess entwickelt wurden, beruhen auf der ursprünglich detaillierten Blot-and-Plunge-Methode31,32,33,34,35 , wobei ein kleines Probenvolumen (z. B. 1-5 μL) auf ein spezialisiertes EM-Gitter aufgebracht wird, bevor die überschüssige Lösung durch physikalische Wechselwirkung des Gitters mit Löschpapier entfernt wird. Der Zeitpunkt dieses Prozesses wird in der Regel empirisch für jede Probe bestimmt, da eine kritische Komponente von Gefrierproben die Dicke des Glaskörpereisfilms ist – wenn das Eis zu dick ist, verschlechtert sich die Abbildungsqualität aufgrund der erhöhten Streuung des Elektronenstrahls dramatisch, während zu dünnes Eis die Proteinorientierungen einschränken und / oder Partikel aus der Mitte der Gitterfolienlöcher ausschließen kann36 . Diese Abhängigkeit von der perfekten Eisdicke für Einzelpartikel-KryoEM hat zu einer breiten Palette von Techniken und Geräten geführt, die Proben einfrieren können, darunter Robotik37,38, Mikrofluidik42 und Ultraschall- oder Sprühgeräte27,39,40,41,42,43,44 . In den letzten Jahren verließen sich einige der beliebtesten Probenvorbereitungsgeräte auf den Einsatz von Robotik zum automatisierten Einfrieren von Proben mit der Blot-and-Plunge-Technik45. Während diese Geräte so konzipiert sind, dass sie reproduzierbar die richtige Eisdicke für die Bildgebung erzeugen, bleiben sie oft zu teuer für den Kauf und Betrieb einzelner Labore und werden im Allgemeinen in KryoEM-Einrichtungen zu Stundensätzen für den Einsatz gefunden. In den letzten Jahren ist die ursprüngliche manuelle Blot-and-Plunge-Technik wieder verstärkt in Gebrauch gekommen3,47,48,49,50,51,52. Tatsächlich kann ein manuell betriebenes Blot-and-Plunge-Gerät qualitativ hochwertige KryoEM-Gitter zu einem Bruchteil der Kosten von Roboter-Gegenstücken erzielen. Darüber hinaus bietet das manuelle Blotting den Benutzern auch mehr Kontrolle über das Blotting, da die Forscher die Art des Blottings (dh Back-Blotting des Gitters, Front-Blotting des Gitters usw.) und die Löschzeit basierend auf jeder einzelnen Probe und Forschungsfragen anpassen können.
In diesem Artikel erfahren Sie, wie biologische Proben mit einer herkömmlichen manuellen Blot-and-Plunge-Verglasungsvorrichtung in Verbindung mit einer speziell entwickelten Dewar-Plattform effektiv eingefroren werden können53. Best Practices, einschließlich der Vorbereitung des Kryogens, der Gitterhandhabung, der Probenanwendung und des Blotting, sowie häufige Fallstricke und Empfehlungen zur Überwindung dieser Hürden werden bereitgestellt. Ratschläge zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Eisdicke zwischen den Gittervorbereitungen und zur Modifikation des Probenlöschens basierend auf dem biologischen Probentyp werden diskutiert. Angesichts der geringen Kosten, die mit dem Kauf und Betrieb des in diesem Manuskript beschriebenen manuellen Kolbens verbunden sind, können Labore auf der ganzen Welt biologische Proben kostengünstig und reproduzierbar für KryoEM vorbereiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Vitrifikation biologischer Proben für die Bildgebung mittels Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (CryoEM) bleibt ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Strukturbestimmung. Die in diesem Protokoll beschriebene manuelle Blot-and-Plunge-Methode stellt eine kostengünstige, zuverlässige und robuste Methode zum schnellen Einfrieren biologischer Proben in dünnen Glaskörpereisschichten für die KryoEM-Bildgebung dar. Mit den im Manuskript beschriebenen Methoden werden die Forscher in der Lage sein, den …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern des Herzik-Labors für kritisches Nachdenken und Feedback zu diesem Manuskript und dem Videoinhalt. M.A.H.Jr. wird von NIH R35 GM138206 und als Searle Scholar unterstützt. H.P.M.N wird durch das Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326) unterstützt. Wir möchten uns auch bei Bill Anderson, Charles Bowman und Dr. Gabriel Lander vom Scripps Research Institute für die Hilfe beim Entwerfen, Zusammenbauen und Testen des im Video gezeigten manuellen Kolbens bedanken.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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