मैनुअल धब्बा-और-डुबकी एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों की ठंड
Summary
यह पांडुलिपि एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए जैविक नमूनों को मैन्युअल रूप से फ्रीज करने के लिए धब्बा-और-डुबकी विधि की रूपरेखा तैयार करती है।
Abstract
एकल-कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉनों के साथ इमेजिंग जैविक नमूनों को ब्याज के बायोमोलेक्यूल्स युक्त विट्रियस बर्फ की एक पतली परत की आवश्यकता होती है। हाल के वर्षों में कई तकनीकी प्रगति के बावजूद, जिन्होंने एकल-कण क्रायोईएम को संरचनात्मक जीव विज्ञान के सबसे आगे धकेल दिया है, जिन तरीकों से नमूनों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए विट्रीफाइड किया जाता है, वे अक्सर दर-सीमित कदम बने रहते हैं। यद्यपि कई हालिया प्रयासों ने नमूना विट्रीफिकेशन के दौरान अक्सर आने वाली बाधाओं को दूर करने के लिए साधन प्रदान किए हैं, जिसमें उपन्यास नमूना समर्थन और अभिनव विट्रीफिकेशन इंस्ट्रूमेंटेशन का विकास शामिल है, पारंपरिक मैन्युअल रूप से संचालित प्लंजर खरीदने और संचालन में आसानी के लिए कम लागत के कारण क्रायोईएम समुदाय में एक प्रधान बना हुआ है। यहां, हम एकल-कण क्रायोईएम द्वारा उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों के विट्रीफिकेशन के लिए एक मानक, गिलोटिन-शैली मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस का उपयोग करने के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, आमतौर पर समस्याओं का सामना करना पड़ा और समस्या निवारण सिफारिशों के लिए जब एक मानक तैयारी एक उपयुक्त नमूना उपज करने में विफल रहता है, तो भी वर्णित हैं।
Introduction
एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) एक शक्तिशाली संरचनात्मक तकनीक है जिसका उपयोग गतिशील जैविक नमूनों की संरचनाओं को निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन 1,2,3,4 तक हल करने के लिए किया जा सकता है। दरअसल, प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर प्रौद्योगिकियों में हाल ही में प्रगति4,5,6,7,8,9,10, इलेक्ट्रॉन स्रोतों में सुधार4,11,12,13,14, और विद्युत चुम्बकीय लेंस स्थिरता15, डेटा अधिग्रहण के निरंतर विकास के साथ युग्मित 16,17 और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पैकेज18,19, ने शोधकर्ताओं को अब नियमित रूप से 3 Å रिज़ॉल्यूशन या बेहतर 4,11,13,14,20,21,22,23 के लिए अच्छी तरह से व्यवहार किए गए नमूनों की संरचनाओं को निर्धारित करने में सक्षम बनाया है . इन बेहतर इमेजिंग और डेटा प्रसंस्करण क्षमताओं के बावजूद, क्रायोईएम ग्रिड तैयारी सफल उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना निर्धारण के लिए सबसे बड़ी बाधा बनी हुई है और अक्सर ईएम वर्कफ़्लो 24,25,26,27 में काफी बाधा के रूप में कार्य करती है।
क्रायोईएम जलीय समाधानों में जैविक नमूनों की इमेजिंग पर निर्भर करता है जो “कांच की तरह” बर्फ की एक पतली फिल्म बनाने के लिए जमे हुए हैं – एक प्रक्रिया जिसे विट्रीफिकेशन के रूप में जाना जाता है – जो देशी जैव रासायनिक राज्य को संरक्षित करता है। क्रायोईएम के लिए जैविक नमूनों का विट्रिफिकेशन 40 वर्षों से अधिक है28,29,30 और इस प्रक्रिया के लिए विकसित की गई कई तकनीकें और उपकरण मूल रूप से विस्तृत धब्बा-और-डुबकी विधि पर निर्भर करते हैं31,32,33,34,35 , जिससे नमूना की एक छोटी मात्रा (उदाहरण के लिए, 1-5 μL) को एक विशेष ईएम ग्रिड पर लागू किया जाता है, इससे पहले कि अतिरिक्त समाधान ब्लोटिंग पेपर के साथ ग्रिड की भौतिक बातचीत का उपयोग करके हटा दिया जाए। इस प्रक्रिया का समय आमतौर पर प्रत्येक नमूने के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है क्योंकि ठंड के नमूनों का एक महत्वपूर्ण घटक विट्रियस बर्फ फिल्म की मोटाई है – यदि बर्फ बहुत मोटी है तो इमेजिंग गुणवत्ता इलेक्ट्रॉन बीम के बढ़े हुए बिखरने के कारण नाटकीय रूप से खराब हो जाती है जबकि बर्फ जो बहुत पतली है, प्रोटीन अभिविन्यास को प्रतिबंधित कर सकती है और / या ग्रिड पन्नी छेद के केंद्र से कणों को बाहर कर सकती है36 . एकल-कण क्रायोईएम के लिए सही बर्फ की मोटाई पर इस निर्भरता ने तकनीकों और उपकरणों की एक विस्तृत सरणी का नेतृत्व किया है जो रोबोटिक्स 37,38, माइक्रोफ्लुइडिक्स 42, और अल्ट्रासोनिक या छिड़काव उपकरणों सहित नमूनों को फ्रीज कर सकते हैं27,39,40,41,42,43,44 . हाल के वर्षों में, कुछ सबसे लोकप्रिय नमूना तैयारी उपकरण धब्बा-और-डुबकी तकनीक 45 का उपयोग करके नमूनों के स्वचालित ठंड के लिए रोबोटिक्स के उपयोग पर भरोसा करते हैं। जबकि इन उपकरणों को इमेजिंग के लिए उचित बर्फ की मोटाई बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, वे अक्सर व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं को खरीदने और संचालित करने के लिए बहुत महंगे रहते हैं और आमतौर पर उपयोग के लिए प्रति घंटा दरों पर क्रायोईएम सुविधाओं के भीतर पाए जाते हैं। हाल के वर्षों में, मूल मैनुअल धब्बा-और-डुबकी तकनीक बढ़ी हुई उपयोग 3,47,48,49,50,51,52 में वापस आ गई है। दरअसल, एक मैन्युअल रूप से संचालित धब्बा-और-डुबकी डिवाइस रोबोट समकक्षों की लागत के एक अंश पर उच्च गुणवत्ता वाले क्रायोईएम ग्रिड प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, मैन्युअल ब्लोटिंग भी ब्लोटिंग पर अधिक उपयोगकर्ताओं को नियंत्रण प्रदान करता है क्योंकि शोधकर्ता ब्लोटिंग के प्रकार को समायोजित कर सकते हैं (यानी, ग्रिड के बैक-ब्लोटिंग, ग्रिड के फ्रंट-ब्लोटिंग, आदि), और प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने और शोध प्रश्नों के आधार पर ब्लोटिंग समय।
इस लेख में, हम एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए डेवर प्लेटफ़ॉर्म 53 के साथ युग्मित पारंपरिक मैनुअल धब्बा-और-डुबकी विट्रीफिकेशन डिवाइस का उपयोग करके जैविक नमूनों को प्रभावी ढंग से फ्रीज करने के तरीके पर विवरण प्रदान करते हैं। क्रायोजेन की तैयारी, ग्रिड हैंडलिंग, नमूना आवेदन, और ब्लोटिंग सहित सर्वोत्तम प्रथाएं, साथ ही साथ इन बाधाओं को दूर करने के तरीके पर सामान्य नुकसान और सिफारिशें प्रदान की जाती हैं। ग्रिड की तैयारी के बीच बर्फ की मोटाई पुनरुत्पादन को बढ़ाने के तरीके और जैविक नमूना प्रकार के आधार पर नमूना ब्लोटिंग को संशोधित करने के तरीके पर सलाह पर चर्चा की जाती है। इस पांडुलिपि में वर्णित मैनुअल प्लंजर की खरीद और संचालन से जुड़ी कम लागत को देखते हुए, दुनिया भर की प्रयोगशालाएं लागत प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से क्रायोईएम के लिए जैविक नमूने तैयार कर सकती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एकल कण क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायोईएम) द्वारा इमेजिंग के लिए जैविक नमूनों का विट्रीफिकेशन सफल संरचना निर्धारण के लिए एक गंभीर रूप से महत्वपूर्ण कदम बना हुआ है। इस प्रोटोकॉल में वर्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि और वीडियो सामग्री पर गंभीर रूप से सोचने और प्रतिक्रिया प्रदान करने के लिए हर्ज़िक लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। M.A.H.Jr. NIH R35 GM138206 द्वारा समर्थित है और एक Searle विद्वान के रूप में। H.P.M.N आणविक बायोफिज़िक्स प्रशिक्षण अनुदान (NIH T32 GM008326) द्वारा समर्थित है। हम स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट में बिल एंडरसन, चार्ल्स बोमन और डॉ गैब्रियल लैंडर को वीडियो में दिखाए गए मैनुअल प्लंजर को डिजाइन करने, इकट्ठा करने और परीक्षण करने में मदद करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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