Manuell flekk-og-dypfrysing av biologiske prøver for kryogen elektronmikroskopi med én partikkel
Summary
Dette manuskriptet skisserer blot-and-plunge-metoden for å fryse biologiske prøver manuelt for enpartikkelkryogen elektronmikroskopi.
Abstract
Avbildning av biologiske prøver med elektroner for høyoppløselig strukturbestemmelse ved enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) krever et tynt lag med glassaktig is som inneholder biomolekylene av interesse. Til tross for mange teknologiske fremskritt de siste årene som har drevet single-partikkel cryoEM i forkant av strukturell biologi, forblir metodene som prøver er vitrifisert for høyoppløselig avbildning ofte det hastighetsbegrensende trinnet. Selv om mange nylige anstrengelser har gitt midler til å overvinne hindringer som ofte oppstår under prøve vitrifisering, inkludert utvikling av nye prøvestøtter og innovativ vitrifiseringsinstrumentering, forblir det tradisjonelle manuelt opererte stempelet en stift i cryoEM-samfunnet på grunn av de lave kostnadene ved kjøp og enkel betjening. Her tilbyr vi detaljerte metoder for bruk av en standard, giljotin-stil manuelt betjent blot-and-plunge-enhet for vitrifisering av biologiske prøver for høyoppløselig avbildning ved enpartikkelkryoEM. I tillegg er det også beskrevet vanlige problemer og feilsøkingsanbefalinger for når et standardpreparat ikke gir et passende eksemplar.
Introduction
Enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) er en kraftig strukturell teknikk som kan brukes til å løse strukturer av dynamiske biologiske prøver til nesten atomoppløsning1,2,3,4. Faktisk, nylige fremskritt innen direkte elektrondetektorteknologier4,5,6,7,8,9,10, forbedringer i elektronkilder4,11,12,13,14, og elektromagnetisk linsestabilitet15, kombinert med fortsatt utvikling av datainnsamling 16,17 og analyseprogramvarepakker18,19, har gjort det mulig for forskere å nå rutinemessig bestemme strukturer av veloppdragne prøver til 3 Å-oppløsning eller bedre4,11,13,14,20,21,22,23 . Til tross for disse forbedrede bilde- og databehandlingsfunksjonene, er cryoEM-nettforberedelse fortsatt det største hinderet for vellykket strukturbestemmelse med høy oppløsning og fungerer ofte som en betydelig flaskehals i EM-arbeidsflyten24,25,26,27.
CryoEM er avhengig av avbildning av biologiske prøver i vandige løsninger som er frosset for å danne en tynn film av “glasslignende” is – en prosess kjent som vitrifisering – som bevarer den innfødte biokjemiske tilstanden. Vitrifisering av biologiske prøver for kryoEM går tilbake over 40 år28,29,30 og mange teknikker og utstyr som er utviklet for denne prosessen, er avhengig av den opprinnelig detaljerte blot-and-plunge-metoden31,32,33,34,35 , der et lite utvalgsvolum (f.eks. 1-5 μL) påføres et spesialisert EM-rutenett før den overskytende løsningen fjernes ved hjelp av fysisk interaksjon av rutenettet med blotting papir. Tidspunktet for denne prosessen er vanligvis empirisk bestemt for hver prøve som en kritisk komponent i fryseprøver er tykkelsen på glasslegemet isfilm – hvis isen er for tykk, forverres bildekvaliteten dramatisk på grunn av økt spredning av elektronstrålen, mens is som er for tynn kan begrense proteinretninger og / eller utelukke partikler fra midten av rutenettfoliehullene36 . Denne avhengigheten av den perfekte istykkelsen for enpartikkelkryoEM har ført til et bredt spekter av teknikker og utstyr som kan fryse prøver, inkludert robotikk37,38, mikrofluidikk42 og ultralyd- eller sprøyteenheter27,39,40,41,42,43,44 . I de senere år er noen av de mest populære prøveforberedelsesenhetene avhengige av bruk av robotikk for automatisert frysing av prøver ved hjelp av blot-and-plunge-teknikken45. Selv om disse enhetene er designet for å reprodusere riktig istykkelse for avbildning, forblir de ofte for dyre for individuelle laboratorier å kjøpe og betjene og finnes vanligvis i cryoEM-anlegg til timepriser for bruk. De siste årene har den opprinnelige manuelle blot-and-plunge-teknikken kommet tilbake til økt bruk3,47,48,49,50,51,52. Faktisk kan en manuelt betjent blot-and-plunge-enhet oppnå høykvalitets cryoEM-rutenett til en brøkdel av kostnaden for robotiske kolleger. Videre gir manuell blotting også flere brukere kontroll over blotting som forskere kan justere typen blotting (dvs. back-blotting av rutenettet, front-blotting av rutenettet, etc.), og blotting tid basert på hver enkelt prøve og forskningsspørsmål.
I denne artikkelen gir vi detaljer om hvordan du effektivt fryser biologiske prøver ved hjelp av en tradisjonell manuell blot-and-plunge vitrification-enhet kombinert med en spesialdesignet dewar-plattform53. Beste praksis, inkludert forberedelse av kryogen, rutenetthåndtering, prøveapplikasjon og blotting, samt vanlige fallgruver og anbefalinger om hvordan du kan overvinne disse hindringene, er gitt. Råd om hvordan du øker istykkelsen reproduserbarhet mellom nettpreparater og hvordan du modifiserer prøveblussing basert på biologisk prøvetype diskuteres. Gitt de lave kostnadene forbundet med kjøp og drift av det manuelle stempelet som er beskrevet i dette manuskriptet, kan laboratorier over hele kloden forberede biologiske prøver for kryoEM på en kostnadseffektiv og reproduserbar måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitrifisering av biologiske prøver for avbildning ved enpartikkel kryogene elektronmikroskopi (cryoEM) er fortsatt et kritisk viktig skritt for vellykket strukturbestemmelse. Den manuelle blot-and-plunge-metoden som er beskrevet i denne protokollen representerer en kostnadseffektiv, pålitelig og robust metode for rask frysing av biologiske prøver i tynne filmer av glassaktig is for kryoEM-avbildning. Ved hjelp av metodene som er skissert i manuskriptet, vil forskerne kunne montere og betjene det manuelle stempelet, fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Herzik-laboratoriemedlemmene for kritisk tenkning og tilbakemelding på dette manuskriptet og videoinnholdet. M.A.H.Jr. støttes av NIH R35 GM138206 og som Searle Scholar. H.P.M.N støttes av Molecular Biophysics Training Grant (NIH T32 GM008326). Vi vil også takke Bill Anderson, Charles Bowman og Dr. Gabriel Lander ved Scripps Research Institute for hjelp til å designe, montere og teste det manuelle stempelet som vises i videoen.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
Referências
- Hofmann, S., et al. Conformation Space of a Heterodimeric ABC Exporter under Turnover Conditions. Nature. 571 (7766), 580-583 (2019).
- Fica, S. M., Nagai, K. Cryo-Electron Microscopy Snapshots of the Spliceosome: Structural Insights into a Dynamic Ribonucleoprotein Machine. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (10), 791-799 (2017).
- Hirschi, M., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the Lysosomal Calcium-Permeable Channel TRPML3. Nature. 550 (7676), 411-414 (2017).
- Nakane, T., et al. Single-Particle Cryo-EM at Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
- Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of Electron Dose Rate on Electron Counting Images Recorded with the K2 Camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
- Campbell, M. G., et al. Movies of Ice-Embedded Particles Enhance Resolution in Electron Cryo-Microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Brilot, A. F., et al. Beam-Induced Motion of Vitrified Specimen on Holey Carbon Film. Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).
- McMullan, G., et al. Experimental Observation of the Improvement in MTF from Backthinning a CMOS Direct Electron Detector. Ultramicroscopy. 109 (9), 1144-1147 (2009).
- Feathers, J. R., Spoth, K. A., Fromme, J. C. Experimental evaluation of super-resolution imaging and magnification choice in single-particle cryo-EM. Journal of Structural Biology: X. 5, 100047 (2021).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: Anisotropic Correction of Beam-Induced Motion for Improved Cryo-Electron Microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-Resolution Protein Structure Determination by Cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
- Fislage, M., Shkumatov, A. V., Stroobants, A., Efremov, R. G. Assessing the JEOL CRYO ARM 300 for High-Throughput Automated Single-Particle Cryo-EM in a Multiuser Environment. IUCrJ. 7 (4), 707-718 (2020).
- Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving Individual Atoms of Protein Complex by Cryo-Electron Microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
- Danev, R., Yanagisawa, H., Kikkawa, M. Cryo-Electron Microscopy Methodology: Current Aspects and Future Directions. Trends in Biochemical Sciences. 44 (10), 837-848 (2019).
- Herzik, M. A. Cryo-Electron Microscopy Reaches Atomic Resolution. Nature. 587 (7832), 39-40 (2020).
- Cheng, A., et al. Leginon: New Features and Applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Suloway, C., et al. Automated Molecular Microscopy: The New Leginon System. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- de la Rosa-Trevín, J. M., et al. Scipion: A Software Framework toward Integration, Reproducibility and Validation in 3D Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for Rapid Unsupervised Cryo-EM Structure Determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Danev, R., Tegunov, D., Baumeister, W. Using the Volta Phase Plate with Defocus for Cryo-EM Single Particle Analysis. eLife. 6, 23006 (2017).
- Naydenova, K., Jia, P., Russo, C. J. Cryo-EM with Sub-1 Å Specimen Movement. Science. 370 (6513), 223-226 (2020).
- Watson, Z. L., et al. Structure of the Bacterial Ribosome at 2 Å Resolution. eLife. 9, 60482 (2020).
- Josephs, T. M., et al. Structure and Dynamics of the CGRP Receptor in Apo and Peptide-Bound Forms. Science. 372 (6538), (2021).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing Preferred Specimen Orientation in Single-Particle Cryo-EM through Tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- D’Imprima, E., Floris, D., Joppe, M., Sánchez, R., Grininger, M., Kühlbrandt, W. Protein Denaturation at the Air-Water Interface and How to Prevent It. eLife. 8, 42747 (2019).
- Han, Y., et al. High-Yield Monolayer Graphene Grids for near-Atomic Resolution Cryoelectron Microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
- Dandey, V. P., et al. Time-Resolved Cryo-EM Using Spotiton. Nature Methods. 17 (9), 897-900 (2020).
- McDowall, A. W., et al. Electron Microscopy of Frozen Hydrated Sections of Vitreous Ice and Vitrified Biological Samples. Journal of Microscopy. 131 (1), 1-9 (1983).
- Dubochet, J., McDowall, A. W. Vitrification of pure water for electron microscopy. Journal of Microscopy. 124 (3), 3-4 (1981).
- Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. Journal of Bacteriology. 155 (1), 381-390 (1983).
- Depelteau, J. S., Koning, G., Yang, W., Briegel, A. An Economical, Portable Manual Cryogenic Plunge Freezer for the Preparation of Vitrified Biological Samples for Cryogenic Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 26 (3), 413-418 (2020).
- Dobro, M. J., Melanson, L. A., Jensen, G. J., McDowall, A. W. Plunge Freezing for Electron Cryomicroscopy. Methods in Enzymology. 481, 63-82 (2010).
- Cavalier, A., Spehner, D., Humbel, B. M. Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 15 (5), 469-470 (2009).
- Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of Macromolecular Complexes for Cryo-Electron Microscopy. Nat. Protoc. 2 (12), 3239-3246 (2007).
- Carragher, B., et al. Current Outcomes When Optimizing ‘Standard’ Sample Preparation for Single-particle Cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Noble, A. J., et al. Routine Single Particle CryoEM Sample and Grid Characterization by Tomography. eLife. 7, 34257 (2018).
- Resch, G. P., Brandstetter, M., Konigsmaier, L., Urban, E., Pickl-Herk, A. M. Immersion Freezing of Suspended Particles and Cells for Cryo-Electron Microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 803-814 (2011).
- Resch, G. P., et al. Immersion Freezing of Biological Specimens: Rationale, Principles, and Instrumentation. Cold Spring Harbor Protocols. 7, 778-782 (2011).
- Jain, T., Sheehan, P., Crum, J., Carragher, B., Potter, C. S. Spotiton: A Prototype for an Integrated Inkjet Dispense and Vitrification System for Cryo-TEM. Journal of Structural Biology. 179 (1), 68-75 (2012).
- Razinkov, I., et al. A New Method for Vitrifying Samples for CryoEM. Journal of Structural Biology. 195 (2), 190-198 (2016).
- Dandey, V. P., et al. Spotiton: New Features and Applications. Journal of Structural Biology. 202 (2), 161-169 (2018).
- Lu, Z., et al. Monolithic Microfluidic Mixing-Spraying Devices for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy. Journal of Structural Biology. 168 (3), 388-395 (2009).
- Feng, X., et al. A Fast and Effective Microfluidic Spraying-Plunging Method for High-Resolution Single-Particle Cryo-EM. Structure. 25 (4), 663-670 (2017).
- Rubinstein, J. L., et al. Shake-It-off: A Simple Ultrasonic Cryo-EM Specimen-Preparation Device. Acta Crystallographica Section D. 75 (12), 1063-1070 (2019).
- Lawson, C. L., et al. EMDataBank.Org: Unified Data Resource for CryoEM. Nucleic Acids Res. 39, 456-464 (2011).
- Frederik, P. M., Hubert, D. H. Cryoelectron Microscopy of Liposomes. Methods in Enzymology. 391, 431-448 (2005).
- Dambacher, C. M., Worden, E. J., Herzik, M. A., Martin, A., Lander, G. C. Atomic Structure of the 26S Proteasome Lid Reveals the Mechanism of Deubiquitinase Inhibition. eLife. 5, 13027 (2016).
- Zubcevic, L., et al. Conformational Ensemble of the Human TRPV3 Ion Channel. Nature Communications. 9 (1), 4773 (2018).
- Zubcevic, L., et al. Cryo-Electron Microscopy Structure of the TRPV2 Ion Channel. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (2), 180-186 (2016).
- Yoo, J., Wu, M., Yin, Y., Herzik, M. A., Lander, G. C., Lee, S. -. Y. Cryo-EM Structure of a Mitochondrial Calcium Uniporter. Science. 361 (6401), 506-511 (2018).
- Fribourgh, J. L., et al. Dynamics at the Serine Loop Underlie Differential Affinity of Cryptochromes for CLOCK:BMAL1 to Control Circadian Timing. eLife. 9, 55275 (2020).
- Hirschi, M., et al. AcrIF9 Tethers Non-Sequence Specific DsDNA to the CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex. Nature Communications. 11 (1), 2730 (2020).
- Herzik, M. A. Manual-Plunging CryoEM Grids | Herzik Lab. Herzik Lab UCSD. , (2021).
