Congelación manual de muestras biológicas para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula
Summary
Este manuscrito describe el método de blot-and-plunge para congelar manualmente especímenes biológicos para microscopía electrónica criogénica de una sola partícula.
Abstract
La obtención de imágenes de especímenes biológicos con electrones para la determinación de la estructura de alta resolución mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) requiere una capa delgada de hielo vítreo que contenga las biomoléculas de interés. A pesar de los numerosos avances tecnológicos en los últimos años que han impulsado el crioEM de una sola partícula a la vanguardia de la biología estructural, los métodos por los cuales los especímenes se vitrifican para imágenes de alta resolución a menudo siguen siendo el paso limitante de velocidad. Aunque numerosos esfuerzos recientes han proporcionado medios para superar los obstáculos que se encuentran con frecuencia durante la vitrificación de muestras, incluido el desarrollo de nuevos soportes de muestra e instrumentación de vitrificación innovadora, el émbolo tradicional operado manualmente sigue siendo un elemento básico en la comunidad crioEM debido al bajo costo de compra y la facilidad de operación. Aquí, proporcionamos métodos detallados para el uso de un dispositivo estándar de blot-and-plunge operado manualmente estilo guillotina para la vitrificación de especímenes biológicos para imágenes de alta resolución mediante crioEM de una sola partícula. Además, también se describen los problemas más comunes y las recomendaciones de solución de problemas para cuando una preparación estándar no produce una muestra adecuada.
Introduction
La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) es una poderosa técnica estructural que se puede utilizar para resolver estructuras de especímenes biológicos dinámicos a una resolución casi atómica1,2,3,4. De hecho, los recientes avances en las tecnologías de detectores directos de electrones4,5,6,7,8,9,10, las mejoras en las fuentes de electrones4,11,12,13,14 y la estabilidad de las lentes electromagnéticas15, junto con el desarrollo continuo de la adquisición de datos 16,17 y los paquetes de software de análisis18,19, han permitido a los investigadores determinar ahora rutinariamente estructuras de especímenes de buen comportamiento a una resolución de 3 Å o mejor4,11,13,14,20,21,22,23 . A pesar de estas capacidades mejoradas de procesamiento de imágenes y datos, la preparación de la red cryoEM sigue siendo el mayor impedimento para la determinación exitosa de la estructura de alta resolución y, a menudo, sirve como un cuello de botella considerable en el flujo de trabajo de EM24,25,26,27.
CryoEM se basa en la obtención de imágenes de muestras biológicas en soluciones acuosas que se congelan para formar una película delgada de hielo “similar al vidrio”, un proceso conocido como vitrificación, que preserva el estado bioquímico nativo. La vitrificación de muestras biológicas para crioEM se remonta a más de 40 años28,29,30 y muchas técnicas y equipos que se han desarrollado para este proceso se basan en el método de blot-and-plunge originalmente detallado31,32,33,34,35 , mediante el cual se aplica un pequeño volumen de muestra (por ejemplo, 1-5 μL) a una rejilla EM especializada antes de eliminar el exceso de solución mediante la interacción física de la rejilla con papel secante. El momento de este proceso generalmente se determina empíricamente para cada espécimen, ya que un componente crítico de las muestras de congelación es el grosor de la película de hielo vítreo: si el hielo es demasiado grueso, la calidad de la imagen se deteriora dramáticamente debido al aumento de la dispersión del haz de electrones, mientras que el hielo que es demasiado delgado puede restringir las orientaciones de las proteínas y / o excluir partículas del centro de los orificios de la lámina de la rejilla36 . Esta dependencia del espesor de hielo perfecto para la crioEM de una sola partícula ha dado lugar a una amplia gama de técnicas y equipos que pueden congelar muestras, incluida la robótica37,38, la microfluídica42 y los dispositivos ultrasónicos o de pulverización27,39,40,41,42,43,44 . En los últimos años, algunos de los dispositivos de preparación de muestras más populares se basan en el uso de la robótica para la congelación automatizada de muestras utilizando la técnica de blot-and-plunge45. Si bien estos dispositivos están diseñados para crear de manera reproducible un espesor de hielo adecuado para las imágenes, a menudo siguen siendo demasiado caros para que los laboratorios individuales los compren y operen y generalmente se encuentran dentro de las instalaciones de crioEM a precios por hora para su uso. En los últimos años, la técnica manual original de blot-and-plunge ha vuelto a ser un uso cada vez mayor3,47,48,49,50,51,52. De hecho, un dispositivo de blot-and-plunge operado manualmente puede lograr rejillas crioEM de alta calidad a una fracción del costo de las contrapartes robóticas. Además, el blotting manual también ofrece a los usuarios más control sobre el blotting, ya que los investigadores pueden ajustar el tipo de blotting (es decir, el back-blotting de la cuadrícula, el front-blotting de la cuadrícula, etc.), y el tiempo de blotting en función de cada muestra individual y preguntas de investigación.
En este artículo, proporcionamos detalles sobre cómo congelar eficazmente muestras biológicas utilizando un dispositivo de vitrificación manual tradicional de borrado y inmersión junto con una plataforma dewar diseñada a medida53. Se proporcionan las mejores prácticas, incluida la preparación del criógeno, el manejo de la rejilla, la aplicación de muestras y el borrado, así como las trampas comunes y las recomendaciones sobre cómo superar estos obstáculos. Se discuten consejos sobre cómo aumentar la reproducibilidad del espesor del hielo entre las preparaciones de rejilla y cómo modificar el borrado de muestras en función del tipo de muestra biológica. Dado el bajo costo asociado con la compra y operación del émbolo manual descrito en este manuscrito, los laboratorios de todo el mundo pueden preparar especímenes biológicos para crioEM de una manera rentable y reproducible.
Protocol
Representative Results
Discussion
La vitrificación de especímenes biológicos para la obtención de imágenes mediante microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (cryoEM) sigue siendo un paso de importancia crítica para la determinación exitosa de la estructura. El método manual de borrado y inmersión descrito en este protocolo representa un método rentable, confiable y robusto para congelar rápidamente muestras biológicas en películas delgadas de hielo vítreo para imágenes crioEM. Utilizando los métodos descritos en el man…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Herzik por pensar críticamente y proporcionar comentarios sobre este manuscrito y el contenido del video. M.A.H.Jr. cuenta con el apoyo de NIH R35 GM138206 y como Searle Scholar. H.P.M.N cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Biofísica Molecular (NIH T32 GM008326). También nos gustaría agradecer a Bill Anderson, Charles Bowman y al Dr. Gabriel Lander en el Instituto de Investigación Scripps por su ayuda para diseñar, ensamblar y probar el émbolo manual que se muestra en el video.
Materials
| 4 slot grid storage box | Ted Pella | 160-40 | |
| 14 gauge flat metal dispensing tip | Amazon | B07M7YWWLT | |
| 22×22 mm square glass coverslip | Sigma | C9802-1PAK | |
| 60 mm glass Petri dish to store grids | Fisher | 08-747A | |
| 100 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747D | |
| 150 mm glass Petri dish to store Whatman paper | Fisher | 08-747F | |
| 250 mL beaker | Fisher | 02-555-25B | |
| Blue styrofoam dewar | Spear Lab | FD-500 | |
| Brass ethane vessel | Lasco | 17-4075 | |
| Clamping tweezers | Ted Pella | 38825 | |
| Delicate task wipes | Fisher | 06-666 | |
| Dual-stage regulator with control valve | Airgas | Y12N245D580-AG | |
| Dewer grid base | UCSD | ||
| Ethane platform | UCSD | ||
| Ethane propane tank | Praxair | ET PR50ZU-G | ethane (50%) : propane (50%) in a high-pressure tank |
| Ethane tank | Praxair | UN1035 | ethane (100%) |
| Flexible arm task light | Amscope | LED-11CR | |
| Grids (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q325AR1.3 | |
| Humidifier | Target | 719438 | |
| Hygrometer | ThermoPro | B01H1R0K68 | |
| Lab coat | UCSD | ||
| Liquid Nitrogen dewar | Worthington | LD4 | |
| Liquid Nitrogen gloves | Fisher | 19-059-925 | |
| Manual plunger stand (black stand + foot pedal) | UCSD | ||
| Mark 5 (plunging platform) | UCSD | ||
| Nitrile gloves | VWR | 82026-424 | |
| P20 pipette | Eppendorf | 13-690-029 | |
| PCR tubes | Eppendorf | E0030124286 | |
| Pipette tips | ibis scientific | 63300005 | |
| Ring lamp | Amazon | B07HMR4H8G | |
| Safety glasses | UCSD | ||
| Scissors | Amazon | Fiskars 01-004761J | |
| Screw driver | Ironside | 354711 | |
| Tape | Fisher | 15-901-10R | |
| Tweezer to transfer grid box | Amazon | LTS-3 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-171-130 | |
| Whatman blotting paper | Fisher | 1001-090 |
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