אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
זה מבוסס היטב כי צמיחת המושבה של פטריות חוטים, תלוי בעיקר בשינויים בהייפאה / תפטירי שיעור הצמיחה apical, מוערך מקרוסקופית על מדיה מוצקה על ידי השוואת גודל המושבה. עם זאת, כדי למדוד כמותית את קצב הצמיחה של זנים פטרייתיים שונים מבחינה גנטית או זנים בתנאי סביבה / צמיחה שונים (pH, טמפרטורה, פחמן ומקורות חנקן, אנטיביוטיקה, וכו ‘) הוא מאתגר. לכן, המרדף אחר גישות משלימות לכמת קינטיקה צמיחה הופך חובה על מנת להבין טוב יותר את צמיחת התא הפטרייתי. יתר על כן, ידוע כי פטריות חוטיות, כולל אספרגילוס spp., יש מצבים ברורים של צמיחה ובידול בתנאים תת-אוויריים על מדיה מוצקה או תרבויות שקועות. כאן, אנו מפרטים שיטה מיקרוסקופית כמותית לניתוח קינטיקה צמיחה של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות הדמיה חיה הן תרבויות שקועות ומדיה מוצקה. אנו לוכדים תמונות, מנתחים וכימתים שיעורי גדילה של זנים פטרייתיים שונים באופן ניתן לשחזור ואמין באמצעות קוד פתוח, תוכנה חופשית לביו-תמונות (למשל, פיג’י), באופן שאינו דורש מומחיות קודמת בניתוח תמונה מהמשתמש.
פטריות סיבים הן בעלי חשיבות חברתית-כלכלית ואקולוגית רבה, הן חיוניות ככלים תעשייתיים / חקלאיים לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה1,2 והן כפתוגנים של צמחייבול 3, חרקי מזיקים4 ובני אדם3. יתר על כן, פטריות חוטיות כגון אספרגילוס nidulans נמצאים בשימוש נרחב כמו אורגניזמים מודל למחקר בסיסי, כגון מחקרים בגנטיקה, תאים וביולוגיה אבולוציונית, כמו גם לחקר הרחבת hyphal5. פטריות חוטיות הן אורגניזמים מקוטבים מאוד המאריכים דרך האספקה המתמשכת של שומנים / חלבונים ממברנה ואת סינתזת דה נובו של דופן התא בקצה המאריך6. תפקיד מרכזי בצמיחת קצה ההיפהל ותחזוקת הקוטביות הוא מבנה מיוחד בשם ‘Spitzenkorper’ (SPK), מבנה מסודר מאוד המורכב בעיקר מרכיבי שלד והתפלגות מקוטבת של Golgi6,7,8.
גירויים / אותות סביבתיים, ממשק אוויר מים כגון, אור, ריכוז CO2, ואת המצב התזונתי אחראים על ההחלטות ההתפתחותיות שנעשו על ידי תבניות אלה9. בתרבויות שקועות (נוזליות) הבידול של A. nidulans מודחק והצמיחה מתרחשת על ידי התארכות טיפ היפלה6. במהלך צמיחה וגטטיבית, נבגים א-מיניים (conidia) לנבוט על ידי הרחבה apical, יצירת רשת לא מופרעת של תאים היפל מחוברים, תפטיר, אשר עשוי להמשיך לגדול ללא הגבלת זמן כל עוד חומרים מזינים ומרחב זמינים. מצד שני, על טיפים היפל מדיה מוצק להאריך ולאחר תקופה מוגדרת של צמיחה וגטטיבית (יכולת התפתחותית), רבייה א-מינית הוא יזם וגבעולי conidiophore אוויר להרחיב מתאי רגל מיוחדים של תפטיר6. אלה מעוררים מבנים רב תאיים התפתחותיים מיוחדים הנקראים conidiophores, המייצרים שרשראות ארוכות של conidia הפלואיד10 שיכולים להתחיל מחדש את הצמיחה בתנאים סביבתיים נוחים.
שיטה נפוצה למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא לחסן נבגים על אגר מיזיני הכלול בצלחת פטרי ולמדוד באופן מקרוסקופי את קוטר המושבה כמה ימים לאחרמכן 11. הקוטר / אזור של המושבה, התלוי ביותר בשינויים בקצב הצמיחה שלי ושל תריסתיים ופחות בצפיפות conidiophore12, משמש לאחר מכן כערך של צמיחה. אמנם, מדידת גודל האוכלוסייה הפטרייתית (מושבה) גדל על משטחים מוצקים הוא די הולם, זה בשום אופן לא המדד המדויק ביותר של צמיחה. בהשוואה לממוצעי רמת האוכלוסייה (ממוצעים של גודל מושבה פטרייתית), מדידות תאים בודדים יכולות ללכוד את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים ולאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות חדשניות של תאים, מדינות13, דינמיקה, מסלולים כמו גם המנגנונים הביולוגיים שבאמצעותם תאים מגיבים לשינויים אנדוגניים וסביבתיים14,15. ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות היא ללא ספק הגישה התצפית כמותית של תא יחיד המועסק ביותר.
להלן, אנו מפרטים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות (כגון ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופיה מקוטבת) כדי ללכוד תמונות, אשר ללא תלות בשימוש המשולב במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות ניתן להשתמש כדי לנתח ולכמת את הצמיחה הקוטבית של זני A. nidulans הן בתרבויות שקועות והן במדיה מוצקה.
ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה בזמן לשגות היא גישה רבת עוצמה כדי להעריך את ההתנהגות התאית בזמן אמת וכמותית ומדויקת לקבוע אם טיפול תרופתי מסוים ו/או התערבות גנטית גורמים לצמיחת תאים הניתנים לזיהוי או הבדלים פנוטיפיים לאורך זמן.
במחקר זה תוארה מתודולוג…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הפרויקט “תשתית מחקר יוונית להדמיה וניטור תהליכים ביולוגיים בסיסיים (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) המיושמת במסגרת הפעולה “חיזוק תשתית המחקר והחדשנות”, הממומנת על ידי התוכנית התפעולית “תחרותיות, יזמות וחדשנות” (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף של יוון ו- E. U.
µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
Biotin | Merck | B4639 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
Peptone | Millipore | 68971 | |
Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
Potassium chloride | Merck | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
Sodium chloride | Merck | S7653 | |
Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
ZnSO4 |