ניתוח כמותי של אספרגילוס nidulans קצב הצמיחה באמצעות מיקרוסקופיה חיה ותוכנה בקוד פתוח
Summary
אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות כדי ללכוד תמונות, לנתח ולכומת קינטיקה צמיחה של הפטרייה חוטית A. nidulans הן בתרבויות שקועות ומדיה מוצקה. פרוטוקול זה יכול לשמש בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
Abstract
זה מבוסס היטב כי צמיחת המושבה של פטריות חוטים, תלוי בעיקר בשינויים בהייפאה / תפטירי שיעור הצמיחה apical, מוערך מקרוסקופית על מדיה מוצקה על ידי השוואת גודל המושבה. עם זאת, כדי למדוד כמותית את קצב הצמיחה של זנים פטרייתיים שונים מבחינה גנטית או זנים בתנאי סביבה / צמיחה שונים (pH, טמפרטורה, פחמן ומקורות חנקן, אנטיביוטיקה, וכו ‘) הוא מאתגר. לכן, המרדף אחר גישות משלימות לכמת קינטיקה צמיחה הופך חובה על מנת להבין טוב יותר את צמיחת התא הפטרייתי. יתר על כן, ידוע כי פטריות חוטיות, כולל אספרגילוס spp., יש מצבים ברורים של צמיחה ובידול בתנאים תת-אוויריים על מדיה מוצקה או תרבויות שקועות. כאן, אנו מפרטים שיטה מיקרוסקופית כמותית לניתוח קינטיקה צמיחה של פטריית המודל אספרגילוס nidulans, באמצעות הדמיה חיה הן תרבויות שקועות ומדיה מוצקה. אנו לוכדים תמונות, מנתחים וכימתים שיעורי גדילה של זנים פטרייתיים שונים באופן ניתן לשחזור ואמין באמצעות קוד פתוח, תוכנה חופשית לביו-תמונות (למשל, פיג’י), באופן שאינו דורש מומחיות קודמת בניתוח תמונה מהמשתמש.
Introduction
פטריות סיבים הן בעלי חשיבות חברתית-כלכלית ואקולוגית רבה, הן חיוניות ככלים תעשייתיים / חקלאיים לייצור אנזימים ואנטיביוטיקה1,2 והן כפתוגנים של צמחייבול 3, חרקי מזיקים4 ובני אדם3. יתר על כן, פטריות חוטיות כגון אספרגילוס nidulans נמצאים בשימוש נרחב כמו אורגניזמים מודל למחקר בסיסי, כגון מחקרים בגנטיקה, תאים וביולוגיה אבולוציונית, כמו גם לחקר הרחבת hyphal5. פטריות חוטיות הן אורגניזמים מקוטבים מאוד המאריכים דרך האספקה המתמשכת של שומנים / חלבונים ממברנה ואת סינתזת דה נובו של דופן התא בקצה המאריך6. תפקיד מרכזי בצמיחת קצה ההיפהל ותחזוקת הקוטביות הוא מבנה מיוחד בשם ‘Spitzenkorper’ (SPK), מבנה מסודר מאוד המורכב בעיקר מרכיבי שלד והתפלגות מקוטבת של Golgi6,7,8.
גירויים / אותות סביבתיים, ממשק אוויר מים כגון, אור, ריכוז CO2, ואת המצב התזונתי אחראים על ההחלטות ההתפתחותיות שנעשו על ידי תבניות אלה9. בתרבויות שקועות (נוזליות) הבידול של A. nidulans מודחק והצמיחה מתרחשת על ידי התארכות טיפ היפלה6. במהלך צמיחה וגטטיבית, נבגים א-מיניים (conidia) לנבוט על ידי הרחבה apical, יצירת רשת לא מופרעת של תאים היפל מחוברים, תפטיר, אשר עשוי להמשיך לגדול ללא הגבלת זמן כל עוד חומרים מזינים ומרחב זמינים. מצד שני, על טיפים היפל מדיה מוצק להאריך ולאחר תקופה מוגדרת של צמיחה וגטטיבית (יכולת התפתחותית), רבייה א-מינית הוא יזם וגבעולי conidiophore אוויר להרחיב מתאי רגל מיוחדים של תפטיר6. אלה מעוררים מבנים רב תאיים התפתחותיים מיוחדים הנקראים conidiophores, המייצרים שרשראות ארוכות של conidia הפלואיד10 שיכולים להתחיל מחדש את הצמיחה בתנאים סביבתיים נוחים.
שיטה נפוצה למדידת צמיחה פטרייתית חוטית היא לחסן נבגים על אגר מיזיני הכלול בצלחת פטרי ולמדוד באופן מקרוסקופי את קוטר המושבה כמה ימים לאחרמכן 11. הקוטר / אזור של המושבה, התלוי ביותר בשינויים בקצב הצמיחה שלי ושל תריסתיים ופחות בצפיפות conidiophore12, משמש לאחר מכן כערך של צמיחה. אמנם, מדידת גודל האוכלוסייה הפטרייתית (מושבה) גדל על משטחים מוצקים הוא די הולם, זה בשום אופן לא המדד המדויק ביותר של צמיחה. בהשוואה לממוצעי רמת האוכלוסייה (ממוצעים של גודל מושבה פטרייתית), מדידות תאים בודדים יכולות ללכוד את ההטרוגניות של אוכלוסיית התאים ולאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות חדשניות של תאים, מדינות13, דינמיקה, מסלולים כמו גם המנגנונים הביולוגיים שבאמצעותם תאים מגיבים לשינויים אנדוגניים וסביבתיים14,15. ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות היא ללא ספק הגישה התצפית כמותית של תא יחיד המועסק ביותר.
להלן, אנו מפרטים פרוטוקול הדמיה חיה ללא תוויות באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה אור מועברות (כגון ניגודיות פאזה, ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ומיקרוסקופיה מקוטבת) כדי ללכוד תמונות, אשר ללא תלות בשימוש המשולב במיקרוסקופיית פלואורסצנטיות ניתן להשתמש כדי לנתח ולכמת את הצמיחה הקוטבית של זני A. nidulans הן בתרבויות שקועות והן במדיה מוצקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניטור צמיחת תאים פטרייתיים פנוטיפ על ידי מיקרוסקופיה בזמן לשגות היא גישה רבת עוצמה כדי להעריך את ההתנהגות התאית בזמן אמת וכמותית ומדויקת לקבוע אם טיפול תרופתי מסוים ו/או התערבות גנטית גורמים לצמיחת תאים הניתנים לזיהוי או הבדלים פנוטיפיים לאורך זמן.
במחקר זה תוארה מתודולוג…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הפרויקט “תשתית מחקר יוונית להדמיה וניטור תהליכים ביולוגיים בסיסיים (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) המיושמת במסגרת הפעולה “חיזוק תשתית המחקר והחדשנות”, הממומנת על ידי התוכנית התפעולית “תחרותיות, יזמות וחדשנות” (NSRF 2014-2020) ובמימון משותף של יוון ו- E. U.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Referências
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
