हम दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में फिलामेंटस कवक ए निदुलांन के विकास कीजिक्स को कैप्चर करने, विश्लेषण करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर किया जा सकता है।
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि फिलामेंटस कवक की कॉलोनी वृद्धि, ज्यादातर हाइफाई/माइसेलिया एपिकल विकास दर में परिवर्तन पर निर्भर है, कॉलोनी के आकार की तुलना करके जम मीडिया पर अनुमानित है। तथापि, विभिन्न पर्यावरणीय/विकास स्थितियों (पीएच, तापमान, कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों, एंटीबायोटिक दवाओं आदि) के तहत आनुवंशिक रूप से विभिन्न कवक उपभेदों या उपभेदों की वृद्धि दर को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, कवक कोशिका विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए विकास गतिज की मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरक दृष्टिकोणों की खोज अनिवार्य हो जाती है। इसके अलावा, यह सर्वविदित है कि एस्परगिलस स्पीप सहित फिलामेंटस कवक में ठोस मीडिया या जलमग्न संस्कृतियों पर उप-हवाई परिस्थितियों के तहत विकास और भेदभाव के अलग-अलग तरीके हैं। यहां, हम डूबे हुए संस्कृतियों और ठोस मीडिया दोनों में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके मॉडल कवक एस्परगिलस निदुलन्सके विकास का मूल्यांकन करने के लिए एक मात्रात्मक सूक्ष्म विधि का विस्तार करते हैं। हम एक खुले स्रोत, जैव-छवियों के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी) का उपयोग करके एक खुले स्रोत, मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न फंगल उपभेदों की छवियों को कैप्चर, विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करते हैं, जिससे उपयोगकर्ता से किसी भी पूर्व छवि विश्लेषण विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है।
फिलामेंटस कवक महान सामाजिक आर्थिक और पारिस्थितिक महत्व के हैं, एंजाइम और एंटीबायोटिकउत्पादन1,2 के लिए औद्योगिक/कृषि उपकरणों के रूप में महत्वपूर्ण होने के नाते और फसल पौधों के रोगजनकों के रूप में3,कीट कीड़े4 और मनुष्य3। इसके अलावा, एस्परगिलस निदुलन जैसे फिलामेंटस कवक का व्यापक रूप से मौलिक अनुसंधान के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया जाता है, जैसे आनुवंशिकी, कोशिका और विकासवादी जीव विज्ञान में अध्ययन के साथ-साथ हाइफाल एक्सटेंशन5के अध्ययन के लिए। फिलामेंटस कवक अत्यधिक ध्रुवीकृत जीव होते हैं जो झिल्ली लिपिड/प्रोटीन की निरंतर आपूर्ति और विस्तार टिप6पर सेल दीवार के डी नोवो संश्लेषण के माध्यम से बढ़ जाते हैं। हाइफाल टिप विकास और ध्रुवीयता रखरखाव में एक केंद्रीय भूमिका ‘स्पित्ज़ेंकोर्पर’ (एसपीके) नामक एक विशेष संरचना है, जो एक अत्यधिक व्यवस्थित संरचना है जिसमें ज्यादातर साइटोस्केलेटलघटक और गोलगी6,7,8के ध्रुवीकृत वितरण शामिल हैं।
पर्यावरणीय उत्तेजनाओं/संकेतों, इस तरह के पानी-हवा इंटरफेस, प्रकाश, सीओ2 एकाग्रता, और पोषण की स्थिति इन सांचों द्वारा किए गए विकासात्मक निर्णयों के लिए जिम्मेदार हैं9। जलमग्न (तरल) संस्कृतियों में ए निदुलनों का भेदभाव दमित होता है और विकास हाइफाल टिप विस्तार6से होता है। वनस्पति वृद्धि के दौरान, अलैंगिक बीजाणु (शंकु) एपिकल एक्सटेंशन द्वारा अंकुरित होते हैं, जो इंटरकनेक्टेड हाइफाल कोशिकाओं, माइसेलियम का एक अविभेदित नेटवर्क बनाते हैं, जो पोषक तत्वों और स्थान उपलब्ध होने तक अनिश्चित काल तक बढ़ता रह सकता है। दूसरी ओर, ठोस मीडिया हाइफल युक्तियों पर और वनस्पति विकास (विकासात्मक क्षमता) की एक परिभाषित अवधि के बाद, अलैंगिक प्रजनन शुरू किया जाता है और हवाई शंकुखोर डंठल माइसेलियम6की विशेष पैर कोशिकाओं से विस्तारित होते हैं। ये विशेष विकासात्मक बहुकोशिकीय संरचनाओं को जन्म देते हैं जिन्हें कोनिओफोरस कहा जाता है, जो हैप्लॉयड कोनिडिया10 की लंबी श्रृंखलाओं का उत्पादन करते हैं जो अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में विकास को पुनः आरंभ कर सकते हैं।
फिलामेंटस फंगल ग्रोथ को मापने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि पेट्री डिश में निहित पोषक तत्वों के पौधों पर बीजाणुओं को टीका लगाना और11दिनों बाद कॉलोनी के व्यास को स्थूल रूप से मापना है । कॉलोनी का व्यास/क्षेत्र, जो माइसेषीय विकास दर में परिवर्तन पर सबसे अधिक निर्भर है और कोनिडोफोर घनत्व12पर कम है, तो विकास के मूल्य के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, ठोस सतहों पर बढ़ते फंगल आबादी (कॉलोनी) आकार को मापने काफी पर्याप्त है, यह किसी भी तरह से विकास का सबसे सटीक उपाय नहीं है। जनसंख्या स्तर औसत (कवक कॉलोनी के आकार का औसत) की तुलना में, एकल कोशिका माप कोशिकाओं की आबादी की विषमता को पकड़ सकते हैं और कोशिकाओं की उप-आबादी की पहचान की अनुमति दे सकते हैं,13,गतिशीलता, रास्ते के साथ-साथ जैविक तंत्र जिसके द्वारा कोशिकाएं अंतर्जात और पर्यावरणीय परिवर्तनों का जवाब देती हैं14,15। समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक सेल विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना यकीनन सबसे व्यापक रूप से नियोजित मात्रात्मक एकल सेल अवलोकन दृष्टिकोण है।
इसके साथ ही, हम छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों (जैसे चरण-विपरीत, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, जो स्वतंत्र रूप से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयुक्त उपयोग से विश्लेषण करने और दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में ए निदुलांन उपभेदों के ध्रुवीय विकास की मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक कोशिका विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना वास्तविक समय में सेलुलर व्यवहार का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है और मात्रात्मक रूप से और सही ढंग से यह निर्धारि?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को आंशिक रूप से परियोजना “एक ग्रीक रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फॉर विजुअलाइजिंग एंड मॉनिटरिंग फंडामेंटल बायोलॉजिकल प्रोसेस (बायोइमेजिंग-जीआर)) (एमआईएस 5002755) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे ऑपरेशनल प्रोग्राम “प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार” (एनएसआरएफ 2014-2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
Biotin | Merck | B4639 | |
Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
Peptone | Millipore | 68971 | |
Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
Potassium chloride | Merck | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
Sodium chloride | Merck | S7653 | |
Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
ZnSO4 |