लाइव माइक्रोस्कोपी और ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एस्परगिलस निदुलन्स विकास दर का मात्रात्मक विश्लेषण
Summary
हम दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में फिलामेंटस कवक ए निदुलांन के विकास कीजिक्स को कैप्चर करने, विश्लेषण करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर किया जा सकता है।
Abstract
यह अच्छी तरह से स्थापित है कि फिलामेंटस कवक की कॉलोनी वृद्धि, ज्यादातर हाइफाई/माइसेलिया एपिकल विकास दर में परिवर्तन पर निर्भर है, कॉलोनी के आकार की तुलना करके जम मीडिया पर अनुमानित है। तथापि, विभिन्न पर्यावरणीय/विकास स्थितियों (पीएच, तापमान, कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों, एंटीबायोटिक दवाओं आदि) के तहत आनुवंशिक रूप से विभिन्न कवक उपभेदों या उपभेदों की वृद्धि दर को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए चुनौतीपूर्ण है । इस प्रकार, कवक कोशिका विकास को बेहतर ढंग से समझने के लिए विकास गतिज की मात्रा निर्धारित करने के लिए पूरक दृष्टिकोणों की खोज अनिवार्य हो जाती है। इसके अलावा, यह सर्वविदित है कि एस्परगिलस स्पीप सहित फिलामेंटस कवक में ठोस मीडिया या जलमग्न संस्कृतियों पर उप-हवाई परिस्थितियों के तहत विकास और भेदभाव के अलग-अलग तरीके हैं। यहां, हम डूबे हुए संस्कृतियों और ठोस मीडिया दोनों में लाइव इमेजिंग का उपयोग करके मॉडल कवक एस्परगिलस निदुलन्सके विकास का मूल्यांकन करने के लिए एक मात्रात्मक सूक्ष्म विधि का विस्तार करते हैं। हम एक खुले स्रोत, जैव-छवियों के लिए मुफ्त सॉफ्टवेयर (जैसे, फिजी) का उपयोग करके एक खुले स्रोत, मुफ्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विभिन्न फंगल उपभेदों की छवियों को कैप्चर, विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करते हैं, जिससे उपयोगकर्ता से किसी भी पूर्व छवि विश्लेषण विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है।
Introduction
फिलामेंटस कवक महान सामाजिक आर्थिक और पारिस्थितिक महत्व के हैं, एंजाइम और एंटीबायोटिकउत्पादन1,2 के लिए औद्योगिक/कृषि उपकरणों के रूप में महत्वपूर्ण होने के नाते और फसल पौधों के रोगजनकों के रूप में3,कीट कीड़े4 और मनुष्य3। इसके अलावा, एस्परगिलस निदुलन जैसे फिलामेंटस कवक का व्यापक रूप से मौलिक अनुसंधान के लिए मॉडल जीवों के रूप में उपयोग किया जाता है, जैसे आनुवंशिकी, कोशिका और विकासवादी जीव विज्ञान में अध्ययन के साथ-साथ हाइफाल एक्सटेंशन5के अध्ययन के लिए। फिलामेंटस कवक अत्यधिक ध्रुवीकृत जीव होते हैं जो झिल्ली लिपिड/प्रोटीन की निरंतर आपूर्ति और विस्तार टिप6पर सेल दीवार के डी नोवो संश्लेषण के माध्यम से बढ़ जाते हैं। हाइफाल टिप विकास और ध्रुवीयता रखरखाव में एक केंद्रीय भूमिका ‘स्पित्ज़ेंकोर्पर’ (एसपीके) नामक एक विशेष संरचना है, जो एक अत्यधिक व्यवस्थित संरचना है जिसमें ज्यादातर साइटोस्केलेटलघटक और गोलगी6,7,8के ध्रुवीकृत वितरण शामिल हैं।
पर्यावरणीय उत्तेजनाओं/संकेतों, इस तरह के पानी-हवा इंटरफेस, प्रकाश, सीओ2 एकाग्रता, और पोषण की स्थिति इन सांचों द्वारा किए गए विकासात्मक निर्णयों के लिए जिम्मेदार हैं9। जलमग्न (तरल) संस्कृतियों में ए निदुलनों का भेदभाव दमित होता है और विकास हाइफाल टिप विस्तार6से होता है। वनस्पति वृद्धि के दौरान, अलैंगिक बीजाणु (शंकु) एपिकल एक्सटेंशन द्वारा अंकुरित होते हैं, जो इंटरकनेक्टेड हाइफाल कोशिकाओं, माइसेलियम का एक अविभेदित नेटवर्क बनाते हैं, जो पोषक तत्वों और स्थान उपलब्ध होने तक अनिश्चित काल तक बढ़ता रह सकता है। दूसरी ओर, ठोस मीडिया हाइफल युक्तियों पर और वनस्पति विकास (विकासात्मक क्षमता) की एक परिभाषित अवधि के बाद, अलैंगिक प्रजनन शुरू किया जाता है और हवाई शंकुखोर डंठल माइसेलियम6की विशेष पैर कोशिकाओं से विस्तारित होते हैं। ये विशेष विकासात्मक बहुकोशिकीय संरचनाओं को जन्म देते हैं जिन्हें कोनिओफोरस कहा जाता है, जो हैप्लॉयड कोनिडिया10 की लंबी श्रृंखलाओं का उत्पादन करते हैं जो अनुकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों में विकास को पुनः आरंभ कर सकते हैं।
फिलामेंटस फंगल ग्रोथ को मापने के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि पेट्री डिश में निहित पोषक तत्वों के पौधों पर बीजाणुओं को टीका लगाना और11दिनों बाद कॉलोनी के व्यास को स्थूल रूप से मापना है । कॉलोनी का व्यास/क्षेत्र, जो माइसेषीय विकास दर में परिवर्तन पर सबसे अधिक निर्भर है और कोनिडोफोर घनत्व12पर कम है, तो विकास के मूल्य के रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, ठोस सतहों पर बढ़ते फंगल आबादी (कॉलोनी) आकार को मापने काफी पर्याप्त है, यह किसी भी तरह से विकास का सबसे सटीक उपाय नहीं है। जनसंख्या स्तर औसत (कवक कॉलोनी के आकार का औसत) की तुलना में, एकल कोशिका माप कोशिकाओं की आबादी की विषमता को पकड़ सकते हैं और कोशिकाओं की उप-आबादी की पहचान की अनुमति दे सकते हैं,13,गतिशीलता, रास्ते के साथ-साथ जैविक तंत्र जिसके द्वारा कोशिकाएं अंतर्जात और पर्यावरणीय परिवर्तनों का जवाब देती हैं14,15। समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक सेल विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना यकीनन सबसे व्यापक रूप से नियोजित मात्रात्मक एकल सेल अवलोकन दृष्टिकोण है।
इसके साथ ही, हम छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रेषित प्रकाश माइक्रोस्कोपी तकनीकों (जैसे चरण-विपरीत, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) और ध्रुवीकृत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एक लेबल-मुक्त लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, जो स्वतंत्र रूप से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के संयुक्त उपयोग से विश्लेषण करने और दोनों जलमग्न संस्कृतियों और ठोस मीडिया में ए निदुलांन उपभेदों के ध्रुवीय विकास की मात्रा निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा कवक कोशिका विकास और फेनोटाइप की निगरानी करना वास्तविक समय में सेलुलर व्यवहार का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है और मात्रात्मक रूप से और सही ढंग से यह निर्धारि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से परियोजना “एक ग्रीक रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर फॉर विजुअलाइजिंग एंड मॉनिटरिंग फंडामेंटल बायोलॉजिकल प्रोसेस (बायोइमेजिंग-जीआर)) (एमआईएस 5002755) द्वारा समर्थित किया गया था, जिसे ऑपरेशनल प्रोग्राम “प्रतिस्पर्धात्मकता, उद्यमिता और नवाचार” (एनएसआरएफ 2014-2020) द्वारा वित्त पोषित किया गया है।
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Referências
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
