라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석
Summary
우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.
Abstract
주로 최면/균주 적 성장률의 변화에 의존하는 필라멘트 균류의 식민지 성장이 식민지 크기를 비교하여 고화된 미디어에 거시적으로 추정된다는 것이 잘 확립되어 있습니다. 그러나, 다른 환경/성장 조건(pH, 온도, 탄소 및 질소 원, 항생제 등)하에서 유전적으로 다른 곰팡이 균주 또는 균주의 성장 속도를 정량적으로 측정하는 것은 도전적이다. 따라서, 성장 운동학을 정량화하기 위한 보완적인 접근법의 추구는 곰팡이 세포 성장을 더 잘 이해하기 위해 필수적이다. 또한, 아스퍼질러스 스프를 포함한 필라멘트 균류는 고체 미디어 또는 침수 된 문화에 대한 공중 조건하에서 뚜렷한 성장과 차별화 모드를 가지고 있는 것으로 잘 알려져 있습니다. 여기서는 침수된 배양과 고체 매체 모두에서 라이브 이미징을 사용하여 모델 균주 아스퍼질러스 니둘란스의성장 운동학을 분석하기 위한 정량적 현미경 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 사용자의 사전 이미지 분석 전문 지식을 필요로하지 않는 방식으로, 오픈 소스, 바이오 이미지 (예를 들어, 피지)에 대한 무료 소프트웨어를 사용하여 재현 가능하고 신뢰할 수있는 방식으로 다른 곰팡이 균주의 성장 속도를 캡처합니다.
Introduction
필라멘트 균류는 큰 사회 경제적 및 생태학적 중요성, 효소 및 항생제 생산을위한 산업 / 농업 도구로 모두 중요하다1,2 및 작물 식물3의병원균으로, 해충 곤충4 및 인간3. 더욱이, 아스퍼질러스 니둘란스와 같은 필라멘트 균류는 유전학, 세포 및 진화 생물학연구뿐만 아니라 최면 연장5의연구와 같은 근본적인 연구를 위한 모델 유기체로서 널리 사용된다. 필라멘트 균류는 연장 팁6에서막 지질 /단백질의 지속적인 공급과 세포벽의 드 노보 합성을 통해 길게 하는 매우 편광 된 유기체이다. 최면 팁 성장 및 극성 유지 보수의 중심적인 역할은 주로 사이토스켈레탈 성분과 골기6,7,8의편광 분포로 구성된 고도로 정렬된 구조인 ‘Spitzenkorper'(SPK)라는 특수 구조이다.
환경 자극/신호, 이러한 물 공기 인터페이스, 빛,CO2 농도 및 영양 상태는 이러한 금형9에의해 이루어진 발달 결정에 대한 책임이 있다. 침수(액체) 배양에서 A. nidulans의 분화는 억압되고 성장은 최면 팁 신장6에의해 발생한다. 식물 성장 중, 무성 포자 (코니디아) 정수 확장에 의해 발아, 상호 연결된 최면 세포의 미분화 네트워크를 형성, 균사체, 영양분과 공간을 사용할 수있는 한 무기한 성장을 계속 할 수있다. 한편, 고체 미디어 최면 팁에 잔인하고 식물성장의 정의된 기간(발달 능력) 후, 무성생식이 개시되고, 공중 호디오포레 줄기는 균사체6의전문 발 세포로부터 확장된다. 이들은 유리한 환경 조건하에서 성장을 다시 시작할 수 있는 haploid conidia10의 긴 사슬을 생성하는 conidiophores에게 불린 특화된 발달 다세포 구조물을 초래합니다.
필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 널리 사용되는 방법은 페트리 접시에 함유 된 영양소 천에 포자를 접종하고 매크로로 며칠 후 식민지의 직경을 측정하는 것입니다11. 식민지의 직경/면적은 근생 성장속도의 변화에 가장 의존하고,12밀도에덜 의존하는 것으로, 성장의 가치로 사용된다. 고체 표면에서 성장하는 곰팡이 인구 (식민지) 크기를 측정하는 것은 매우 적절하지만 결코 가장 정확한 성장 척도는 아닙니다. 인구 수준 평균(곰팡이 식민지 크기의 평균)에 비해, 단일 세포 측정은 세포 집단의 이질성을 포착하고 세포의 새로운 하위 집단의 식별을 허용할 수 있으며,13,역학, 경로뿐만 아니라 세포가 내인성 및 환경 변화에 반응하는 생물학적메커니즘을 14,15. 시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 틀림없이 가장 널리 사용되는 정량적 단일 세포 관찰 접근법입니다.
본 명세서에서는, 전염된 광 현미경 기술(예: 위상 대조, 차동 간섭 대조(DIC), 편광 현미경 검사법을 사용하여 라벨없는 라이브 이미징 프로토콜을 상세히 설명하여 이미지를 캡처하는데, 이는 형광 현미경 현미경의 결합된 사용과 는 독립적으로 A. nidulans 균주의 극성 성장을 분석하고 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시간 경과 현미경 검사법에 의한 곰팡이 세포 성장 및 표현형을 모니터링하는 것은 특정 약물 치료 및/또는 유전 적 개입이 시간이 지남에 따라 검출 가능한 세포 성장 또는 표현성 차이의 결과인지 여부를 실시간으로 정량적으로 정확하게 결정하는 강력한 접근법입니다.
본 연구에서는, 신뢰할 수 있는 살아있는 세포 이미징 방법론이 A. nidulans에서세균관및 최면 팁 성…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 사업은 운영 프로그램 “경쟁력, 기업가 정신 및 혁신”(NSRF 2014-2020)의 자금 지원및 그리스와 EU의 공동 자금 지원을 통해 “연구 혁신 인프라 강화”(MIS)라는 “기초 생물학적 프로세스(BioImaging-GR)”(BioImaging-GR)를 시각화하고 모니터링하기 위한 그리스 연구 인프라”(MIS 5002755)의 프로젝트에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
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