Kvantitativ analyse av Aspergillus nidulans vekstrate ved hjelp av live mikroskopi og programvare med åpen kildekode
Summary
Vi presenterer en etikettfri live bildeprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker for å fange bilder, analysere og kvantifisere vekstkinetikken til den filamentøse soppen A. nidulans i både nedsenkede kulturer og solide medier. Denne protokollen kan brukes sammen med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Det er veletablert at kolonivekst av filamentøse sopp, for det meste avhengig av endringer i hyphae/mycelia apikal vekstrate, er makroskopisk estimert på størknede medier ved å sammenligne kolonistørrelse. Men å kvantitativt måle vekstraten for genetisk forskjellige soppstammer eller stammer under ulike miljø/ vekstforhold (pH, temperatur, karbon og nitrogenkilder, antibiotika, etc.) er utfordrende. Dermed blir jakten på komplementære tilnærminger for å kvantifisere vekstkinetikk obligatorisk for bedre å forstå soppcellevekst. Videre er det velkjent at filamentøse sopp, inkludert Aspergillus spp., har tydelige vekstmåter og differensiering under under-luftforhold på faste medier eller nedsenkede kulturer. Her beskriver vi en kvantitativ mikroskopisk metode for å analysere vekstkinetikken til modellsvampen Aspergillus nidulans, ved hjelp av levende avbildning i både nedsenkede kulturer og faste medier. Vi tar bilder, analyserer og kvantifiserer vekstrater av forskjellige soppstammer på en reproduserbar og pålitelig måte ved hjelp av en åpen kildekode, gratis programvare for biobilder (f.eks. Fiji), på en måte som ikke krever noen tidligere bildeanalyseekspertise fra brukeren.
Introduction
Filamentøse sopp er av stor sosioøkonomisk og økologisk betydning, og er både avgjørende som industrielle / landbruksverktøy for enzym- og antibiotikaproduksjon1,2 og som patogener av avlingsplanter3, skadedyrsinsekter4 og mennesker3. Videre er filamentøse sopp som Aspergillus nidulans mye brukt som modellorganismer for grunnleggende forskning, for eksempel studier i genetikk, celle- og evolusjonsbiologi samt for studiet av hyphal forlengelse5. Filamentøse sopp er svært polariserte organismer som forlenger gjennom kontinuerlig tilførsel av membranlipider / proteiner og de novosyntesen av cellevegg på forlengelsesspissen6. En sentral rolle i hyphalspissens vekst og polaritetsvedlikehold er en spesialisert struktur kalt ‘Spitzenkorper’ (SPK), en høyt bestilt struktur som hovedsakelig består av cytoskeletalkomponenter og polarisert distribusjon av Golgi6,7,8.
Miljøstimuli/signaler, slikt vann-luft-grensesnitt, lys, CO2-konsentrasjon og ernæringsstatus er ansvarlig for utviklingsbeslutningene som tas av disse formene9. I nedsenkede (flytende) kulturer er differensiering av A. nidulans undertrykt og veksten skjer ved hyphalspissforlengelse6. Under vegetativ vekst spiser aseksuelle sporer (conidia) ved apikal forlengelse, og danner et uavklart nettverk av sammenkoblede hyphalceller, myceliet, som kan fortsette å vokse på ubestemt tid så lenge næringsstoffer og plass er tilgjengelige. På den annen side, på faste medier hyphal tips forlenge og etter en definert periode med vegetativ vekst (utviklingskompetanse), aseksuelle reproduksjon er initiert og luft conidiophore stilker strekker seg fra spesialiserte fotceller i mycelium6. Disse gir opphav til spesialiserte utviklingsmessige multicellulære strukturer kalt conidiophores, som produserer lange kjeder av haploid conidia10 som kan starte veksten på nytt under gunstige miljøforhold.
En mye brukt metode for måling av filamentøs soppvekst er å inokulere sporer på næringsagar inneholdt i en Petri-tallerken og makroskopisk måle koloniens diameter noen dager senere11. Koloniens diameter/ område, mest avhengig av endringer i mycelial vekstrate og mindre på conidiophore tetthet12, brukes deretter som en verdi av vekst. Selv om måling av sopppopulasjon (koloni) størrelse som vokser på faste overflater er ganske tilstrekkelig, er det på ingen måte det mest nøyaktige målet på vekst. Sammenlignet med gjennomsnittet på befolkningsnivå (gjennomsnitt av soppkolonistørrelse), kan enkeltcellemålinger fange heterogeniteten til en cellepopulasjon og tillate identifisering av nye underpopulasjoner av celler, stater13, dynamikk, veier samt de biologiske mekanismene som celler reagerer på endogene og miljømessige endringer14,15. Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er uten tvil den mest brukte kvantitative enkeltcelleobservasjonsmetoden.
Heretter beskriver vi en etikettfri live bildebehandlingsprotokoll ved hjelp av overførte lysmikroskopiteknikker (for eksempel fasekontrast, differensialinterferenskontrast (DIC) og polarisert mikroskopi) for å fange bilder, som uavhengig av kombinert bruk av fluorescensmikroskopi kan brukes til å analysere og kvantifisere polar vekst av A. nidulansstammer i både nedsenkede kulturer og faste medier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Overvåking av soppcellevekst og fenotype ved tidsforløpmikroskopi er en kraftig tilnærming for å vurdere cellulær atferd i sanntid og kvantitativt og nøyaktig avgjøre om en bestemt legemiddelbehandling og / eller genetisk intervensjon resulterer i påviselig cellevekst eller fenotypiske forskjeller over tid.
I denne studien ble en pålitelig levende celleavbildningsmetodikk beskrevet for å måle og kvantitativt analysere sopputvikling, inkludert dynamikken i bakterierør og hyphalspiss…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av prosjektet “A Greek Research Infrastructure for Visualizing and Monitoring Fundamental Biological Processes (BioImaging-GR)” (MIS 5002755) som er implementert under aksjonen “Forsterkning av forsknings- og innovasjonsinfrastrukturen”, finansiert av det operative programmet “Competitiveness, Entrepreneurship and Innovation” (NSRF 2014-2020) og medfinansiert av Hellas og E. U.
Materials
| µ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Imaging slides |
| 4-Aminobenzoic acid | Merck | A9878 | |
| azhAΔ ngnAΔ | Genotype: zhAΔ::pyrGAf; ngnAΔ::pyrGAf; pyroA4 pantoB100 / References:Laboratory collection, Athanasopoulos et al., 2013 | ||
| Bacto Casamino Acids | Gibco | 223030 | |
| Biotin | Merck | B4639 | |
| Chloroform | Merck | 67-66-3 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Merck | C8027 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software | Statistical Software | |
| ImageJ | NIH | Image processing and analysis software | |
| Inoculating Loop | Merck | I8263-500EA | |
| Iron(III) phosphate | Merck | 1.03935 | |
| Leica Application Suite X | Leica Microsystems | Microscope software | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck | 63138 | |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Merck | M7899 | |
| Microscope Leica TCS SP8 | Leica Microsystems | ||
| Nicotinamide (Niacinamide) | Supelco | 47865-U | |
| Peptone | Millipore | 68971 | |
| Petri Dishes for Microbiology Culture | KISKER | G090 | |
| Potassium chloride | Merck | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | |
| Pyridoxine hydrochloride | Merck | P6280 | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 1,7 mL, DNase-, RNase and pyrogen free, sterile | KISKER | G052-S | |
| Quali – Microcentrifuge Tubes, 2.0 mL, sterile | KISKER | G053-S | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 100-1000 µL | KISKER | VL004G | |
| Quali – Standard Tips, Bevelled, 1-200 µL | KISKER | VL700G | |
| Quali Microvolume Tips, DNase-, RNase free, 0,1-10 µL/clear | KISKER | GC.TIPS.B | |
| Riboflavin (B2) | Supelco | 47861 | |
| Scalpel blades NO. 11 | OdontoMed2011 | S2771 | |
| Sodium chloride | Merck | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Merck | S8045 | |
| Sodium tetraborate decahydrate | Merck | S9640 | |
| VS151 (PilA-GFP and H1-mRFP) | Genotype: pyrG89; pilA::sgfp::AfpyrG+ argB2 nkuAΔ::argB+ pyroA4 hhoA::mrfp::Afribo+ riboB2 / References:Laboratory collection, Biratsi et al., 2021 | ||
| WT | Genotype: nkuAΔ::argB; pyrG89; pyroA4;pyrG89 / References: TN02A3 -FGSC A1149 | ||
| Yeast Extract | Millipore | 70161 | |
| ZnSO4 |
Referências
- Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215 (2020).
- Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
- Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
- Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
- Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
- Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
- Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
- Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
- Bayram, &. #. 2. 1. 4. ;., Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
- Yu, J. -. H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
- Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
- Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
- Kasprowicz, R., Suman, R., O’Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
- Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
- Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
- Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
- Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613 (2019).
- Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
- Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
- Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy – tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494 (2020).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, 2040-2048 (2009).
- Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391 (2021).
- Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
- Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
- Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
- Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
- Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705 (2017).
- Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -. H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
- Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
- Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
- Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).
