الصفائح الدموية المشتقة من وظائف الحويكل خارج الخلية من يزرع تي
Summary
هنا، نقدم طريقة لعزل Vesicles خارج الخلية (EVs) المستمدة من الصفائح الدموية (PL) واستخدامها لطلاء التيتانيوم (Ti) زرع السطوح. نحن نصف طريقة طلاء الصب قطرة، وEVs الافراج عن الملف الشخصي من الأسطح، والتوافق البيولوجي في المختبر من المركبات الكهربائية المغلفة تي السطوح.
Abstract
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي نانوفيسيكليس البيولوجية التي تلعب دورا رئيسيا في الاتصالات الخلوية. ويشمل محتواها الجزيئات الحيوية النشطة مثل البروتينات والأحماض النووية، والتي تمثل إمكانات كبيرة في الطب التجديدي. في الآونة الأخيرة، أظهرت المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية Lysate (PL) قدرة العظام مماثلة لPL. الى جانب ذلك ، وكثيرا ما تستخدم المواد الحيوية في جراحة العظام أو ترميم الأسنان. هنا، ونحن نقدم طريقة لوظيفية الأسطح تي مع المركبات الكهربائية PL المستمدة من أجل تحسين خصائصها العظام.
يتم عزل المركبات الكهربائية من PL حسب اللونية استبعاد الحجم، وبعد ذلك يتم وظيفية الأسطح تي مع PL-EVs عن طريق إسقاط الصب. ثبت وظيفية من قبل EVs الافراج والتوافق البيولوجي من قبل dehydrogenase اللاكتات (LDH) الافراج عن المقايسة.
Introduction
المركبات الكهربائية هي الحويصلات الغشاء (30-200 نانومتر) تفرزها أي خلية وتلعب دورا رئيسيا في الاتصالات من خلية إلى خلية عن طريق تسليم حمولتها. وهي تحتوي على مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية النشطة التي قد تشمل الأحماض النووية، وعوامل النمو، أو الدهون النشطة بيولوجيا1. لهذه الأسباب، تم تقييم المركبات الكهربائية لاستخدامها المحتمل في العلاجات. من حيث جراحة العظام وتجديد العظام، تم اختبار المركبات الكهربائية من مصادر مختلفة. ومن بينها، ثبت أن المركبات الكهربائية المشتقة من الصفائح الدموية تحفز على إحداث تأثير تمايز على الخلايا الجذعية مع الحفاظ على مستوى منخفض من السمية الخلوية2,3. لذلك، هناك حاجة إلى مزيد من البحوث لاستكشاف إمكانية الجمع بين المركبات الكهربائية مع المواد الحيوية من أجل استخدامها في الممارسة السريرية اليومية.
تستخدم المواد الحيوية القائمة على التيتانيوم على نطاق واسع كسقالات للتدخلات السريرية لشفاء العظام بسبب خصائصها الميكانيكية ، والتوافق البيولوجي العالي ، والمتانة على المدى الطويل4. ومع ذلك، يزرع تي هي مادة خامدة الحيوية، وبالتالي، تقديم قدرة ضعيفة للترابط مع الأنسجة العظمية المحيطة5. ولهذا السبب، تجري دراسة تعديلات التيتانيوم من أجل تحسين أدائها من خلال تحقيق بيئة صغيرة أكثر وظيفية على سطحها4,6,7. وبهذا المعنى، يمكن تثبيت المركبات الكهربائية على التيتانيوم عن طريق المادة الكيميائية8 أو التفاعلات الفيزيائية9,10. المركبات الكهربائية غير المشلوم المستمدة من الخلايا الجذعية أو الضامة تعزيز النشاط الحيوي للتي من خلال تعزيز الالتصاق الخلوي والانتشار مما يؤدي إلى تأثير العظام8,9,10.
هذه المادة سوف تركز على استراتيجية قطرة الصب لطلاء الأسطح تي مع المركبات الكهربائية PL المستمدة بالتفصيل. بالإضافة إلى ذلك، سنقوم بتقييم ملف تعريف إصدار المركبات الكهربائية من السطح المغلف بمرور الوقت وتأكيد توافقه البيولوجي الخلوي في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يهدف هذا البروتوكول إلى توفير تعليمات واضحة للوظائف المركبات الكهربائية على الأسطح تي. ويستند الأسلوب المقدم على استراتيجية قطرة الصب، وهو نوع من physisorption الوظيفية. يوجد ضعف الببليوغرافيا فيما يتعلق بوظيفة المركبات الكهربائية على أسطح Ti ، على الرغم من وجود عدد قليل من الدراسات التي تظهر م…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد مول هذا البحث معهد سالود كارلوس الثالث، الوزير الاقتصادي، الذي شارك في تمويله الصندوق الاجتماعي الأوروبي وصندوق التنمية الإقليمية الأوروبي التابع للصندوق الأوروبي للتنمية الاقتصادية (MS16/00124؛ CP16/00124; PI17/01605)، وDirecció العام d’Investigació، كونسيليريا D’Investigació، حكم البليار (FPI/2046/2017)، وPORA جونيور ديل projecte TALENT PLUS، construyendo سالود، جينيراندو فالور (JUNIOR01/18)، بتمويل من ضريبة السياحة المستدامة لجزر البليار.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
