在这里,我们提出了一种分离来自血小板裂解物(PL)的细胞外囊泡(EV)的方法及其用于包衣钛(Ti)植入物表面的方法。我们描述了滴铸涂层方法,电动汽车从表面的释放曲线,以及电动汽车涂层Ti表面的 体外 生物相容性。
细胞外囊泡(EV)是生物纳米囊泡,在细胞通讯中起关键作用。其含量包括蛋白质和核酸等活性生物分子,在再生医学中具有巨大的潜力。最近,来自血小板裂解物(PL)的EV显示出与PL相当的成骨能力。此外,生物材料经常用于骨科或牙齿修复。在这里,我们提供了一种用PL衍生的EV功能化Ti表面的方法,以改善其成骨性能。
通过尺寸排阻色谱法从PL中分离出EV,然后通过滴铸将Ti表面与PL-EV功能化。功能化通过EV释放和乳酸盐脱氢酶(LDH)释放测定的生物相容性得到证明。
EV是由任何细胞分泌的膜囊泡(30-200nm),通过传递其货物在细胞间通信中起着关键作用。它们含有多种活性生物分子,其中可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质1。由于这些原因,电动汽车已被评估其在治疗中的潜在用途。在骨科和骨再生方面,来自不同来源的EV已经过测试。其中,血小板衍生的EV已被证明可以诱导干细胞的分化作用,同时保持低细胞毒性2,3。因此,需要进一步的研究来探索将EV与生物材料相结合的可能性,以便在日常临床实践中使用它们。
钛基生物材料由于其机械性能、高生物相容性和长期耐用性,被广泛用作骨愈合临床干预的支架4。然而,Ti植入物是一种生物惰性材料,因此与周围骨组织的结合能力较差5。因此,正在研究钛改性,以便通过在其表面实现功能更强大的微环境来提高其性能4,6,7。从这个意义上说,电动汽车可以通过化学8 或物理相互作用与钛锚定9,10。来自干细胞或巨噬细胞的固定化EV通过促进细胞粘附和增殖来增强Ti的生物活性,从而诱导成骨作用8,9,10。
本文将重点介绍使用PL衍生的EV涂覆Ti表面的液滴铸造策略。此外,我们将评估EV在一段时间内从包被表面的释放曲线,并在 体外确认其细胞生物相容性。
该协议旨在为电动汽车在Ti表面上的功能化提供明确的说明。所提出的方法基于液滴铸造策略,这是一种物理吸附类型的功能化。关于Ti表面上的EV功能化,书目很差,尽管很少有研究表明在Ti10上固定EV具有不同的优势。无论如何,探索的一些策略包括生化结合8,聚合物截留9 或滴铸10。虽然通过共价键使用化学涂层可能会实?…
The authors have nothing to disclose.
这项研究由卡洛斯三世社会研究所资助,由欧洲社会基金和ERDF欧洲区域发展基金共同资助(MS16/00124;CP16/00124;PI17/01605)、Direcció General d’Investigació、Conselleria d’Investigació、Govern Balear (FPI/2046/2017)和PROJECTA JUNIOR DEL PROJECTE TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18),由巴利阿里群岛的可持续旅游税资助。
0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
1mL syringe | BD | 303174 | |
96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
Needle | Terumo | 946077135 | |
Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
Tryton X100 | Sigma | T8787 |