Blodplade-afledt ekstracellulær vesikel funktionalisering af Ti implantater
Summary
Her præsenterer vi en metode til isolering af Extracellular Vesicles (EVs) afledt af blodpladelyset (PL) og deres anvendelse til belægning titanium (Ti) implantatoverflader. Vi beskriver drop casting belægning metode, elbiler frigivelse profil fra overfladerne, og in vitro biokompatibilitet af elbiler belagt Ti overflader.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (elbiler) er biologiske nanovesicles, der spiller en central rolle i cellekommunikation. Deres indhold omfatter aktive biomolekyler såsom proteiner og nukleinsyrer, som udgør et stort potentiale i regenerativ medicin. For nylig har elbiler afledt af Blodplade lysat (PL) vist en osteogen kapacitet, der kan sammenlignes med PL. Desuden anvendes biomaterialer ofte i ortopædi eller tandgenopretning. Her tilbyder vi en metode til at functionalisere Ti overflader med PL-afledte elbiler for at forbedre deres osteogene egenskaber.
Elbiler er isoleret fra PL efter størrelse eksklusionskromatografi, og bagefter er Ti overflader funktionaliseret med PL-elbiler ved drop casting. Funktionalisering er bevist ved elbiler frigivelse og dens biokompatibilitet ved laktat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay.
Introduction
Elbiler er membran vesikler (30-200 nm) udskilles af enhver celle og spiller en central rolle i celle-til-celle kommunikation ved at levere deres last. De indeholder en række aktive biomolekyler, der kan omfatte nukleinsyrer, vækstfaktorer, eller bioaktive lipider1. Af disse grunde er elbiler blevet evalueret for deres potentielle anvendelse i terapi. Med hensyn til ortopædi og knogle regenerering, elbiler fra forskellige kilder er blevet testet. Blandt dem har blodplade-afledte elbiler vist sig at fremkalde en differentiering effekt på stamceller og samtidig opretholde en lav cytotoksisk profil2,3. Derfor er der behov for yderligere forskning for at undersøge muligheden for at kombinere elbiler med biomaterialer for at bruge dem i daglig klinisk praksis.
Titanium-baserede biomaterialer er meget udbredt som stilladser for knoglehelbredelse kliniske interventioner på grund af deres mekaniske egenskaber, høj biokompatibilitet, og langsigtet holdbarhed4. Ikke desto mindre er Ti-implantater et bioinertmateriale og udgør derfor en dårlig evne til at binde sig til det omgivende knoglevæv5. Af denne grund undersøges titaniumændringer for at forbedre deres ydeevne ved at opnå et mere funktionelt mikromiljø på overfladen4,6,7. I denne forstand kan elbiler forankres til titanium ved kemiske8 eller fysiske interaktioner9,10. Immobiliserede elbiler, der stammer fra stamceller eller makrofager, forbedrer Ti’s bioaktivitet ved at fremme cellulær vedhæftning og spredning og derved fremkalde en osteogen effekt8,9,10.
Denne artikel vil fokusere på en drop casting strategi for belægning Ti overflader med PL-afledte elbiler i detaljer. Derudover vil vi evaluere elbilers frigivelsesprofil fra den coatede overflade over tid og bekræfte dens cellulære biokompatibilitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol har til formål at give klare instruktioner til elbiler funktionalisering på Ti overflader. Den præsenterede metode er baseret på en drop casting strategi, som er en fysioterapeutption type funktionalisering. Dårlig bibliografi eksisterer med hensyn til elbiler funktionalisering på Ti overflader, selv om der er få undersøgelser, der viser forskellige fordele ved at immobilisere elbiler på Ti10. Anyway, nogle af de undersøgte strategier omfatter biokemisk b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning er finansieret af Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansieret af ESF’s Europæiske Socialfond og EFRU’s Europæiske Fond for Regionaludvikling (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) og PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansieret af den bæredygtige turismeskat på De Baleariske Øer.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
