Van bloedplaatjes afgeleide extracellulaire vesikel functionalisatie van Ti-implantaten
Summary
Hier presenteren we een methode voor de isolatie van extracellulaire blaasjes (EV’s) afgeleid van de bloedplaatjeslysaten (PL) en hun gebruik voor het coaten van titanium (Ti) implantaatoppervlakken. We beschrijven de drop casting coating methode, de EV’s release profiel van de oppervlakken, en in vitro biocompatibiliteit van EV’s gecoat Ti oppervlakken.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV’s) zijn biologische nanovesicles die een sleutelrol spelen in de celcommunicatie. Hun inhoud omvat actieve biomoleculen zoals eiwitten en nucleïnezuren, die een groot potentieel bieden in de regeneratieve geneeskunde. Meer recent hebben EV’s afgeleid van Platelet Lysate (PL) een osteogene capaciteit getoond die vergelijkbaar is met PL. Bovendien worden biomaterialen vaak gebruikt in orthopedie of tandheelkundige restauratie. Hier bieden we een methode om Ti-oppervlakken te functionaliseren met PL-afgeleide EV’s om hun osteogene eigenschappen te verbeteren.
EV’s worden geïsoleerd van PL door grootte-uitsluitingschromatografie en daarna worden Ti-oppervlakken gefunctionaliseerd met PL-EV’s door drop casting. Functionalisatie wordt bewezen door ev-afgifte en de biocompatibiliteit ervan door de lactaatdehydrogenase (LDH) release assay.
Introduction
EV’s zijn membraanblaasjes (30-200 nm) die door elke cel worden uitgescheiden en spelen een sleutelrol in cel-naar-cel communicatie door hun lading af te leveren. Ze bevatten een verscheidenheid aan actieve biomoleculen die nucleïnezuren, groeifactoren of bioactieve lipiden kunnen bevatten1. Om deze redenen zijn EV’s geëvalueerd op hun potentiële gebruik in therapeutica. Op het gebied van orthopedie en botregeneratie zijn EV’s uit verschillende bronnen getest. Onder hen is aangetoond dat van bloedplaatjes afgeleide EV’s een differentiatie-effect op stamcellen induceren met behoud van een laag cytotoxisch profiel2,3. Daarom is verder onderzoek nodig om de mogelijkheid te onderzoeken om EV’s te combineren met biomaterialen om ze in de dagelijkse klinische praktijk te gebruiken.
Op titanium gebaseerde biomaterialen worden veel gebruikt als steigers voor botgenezende klinische interventies vanwege hun mechanische eigenschappen, hoge biocompatibiliteit en duurzaamheid op lange termijn4. Niettemin zijn Ti-implantaten een bio-inert materiaal en vertonen daarom een slecht vermogen om zich te hechten aan het omliggende botweefsel5. Om deze reden worden titaniummodificaties bestudeerd om hun prestaties te verbeteren door een meer functionele micro-omgeving op het oppervlak te bereiken4,6,7. In die zin kunnen EV’s aan titanium worden verankerd door chemische8 of fysische interacties9,10. Geïmmobiliseerde EV’s afgeleid van stamcellen of macrofagen verbeteren de bioactiviteit van Ti door cellulaire adhesie en proliferatie te bevorderen en zo een osteogeen effect te induceren8,9,10.
Dit artikel zal zich in detail richten op een drop casting-strategie voor het coaten van Ti-oppervlakken met PL-afgeleide EV’s. Daarnaast zullen we het afgifteprofiel van EV’s van het gecoate oppervlak in de loop van de tijd evalueren en de cellulaire biocompatibiliteit in vitro bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is bedoeld om duidelijke instructies te geven voor de functionalisatie van EV’s op Ti-oppervlakken. De gepresenteerde methode is gebaseerd op een drop casting-strategie, een physisorptietype van functionalisatie. Er bestaat een slechte bibliografie met betrekking tot de functionalisering van EV’s op Ti-oppervlakken, hoewel er weinig studies zijn die verschillende voordelen aantonen door EV’s op Ti10 te immobiliseren. Hoe dan ook, sommige van de onderzochte strategieën omvatten bioche…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medegefinancierd door het ESF Europees Sociaal Fonds en het EFRO Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), de Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), en PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), gefinancierd door de duurzame toerismebelasting van de Balearen.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
