Fonctionnalisation des vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes des implants Ti
Summary
Nous présentons ici une méthode d’isolement des vésicules extracellulaires (VE) dérivées des lysats plaquettaires (PL) et leur utilisation pour le revêtement des surfaces implantaires en titane (Ti). Nous décrivons la méthode de revêtement par coulée goutte, le profil de libération des VE des surfaces et la biocompatibilité in vitro des surfaces Ti revêtues de VE.
Abstract
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanovésicules biologiques qui jouent un rôle clé dans la communication cellulaire. Leur contenu comprend des biomolécules actives telles que des protéines et des acides nucléiques, qui présentent un grand potentiel en médecine régénérative. Plus récemment, les VÉHICULES dérivés du lysat plaquettaire (PL) ont montré une capacité ostéogénique comparable à la PL. En outre, les biomatériaux sont fréquemment utilisés en orthopédie ou en restauration dentaire. Ici, nous fournissons une méthode pour fonctionnaliser les surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL afin d’améliorer leurs propriétés ostéogéniques.
Les VE sont isolés du PL par chromatographie d’exclusion de taille, puis les surfaces Ti sont fonctionnalisées avec des PL-EV par coulée goutte. La fonctionnalisation est prouvée par la libération des VE et sa biocompatibilité par le test de libération de lactate déshydrogénase (LDH).
Introduction
Les VE sont des vésicules membranaires (30-200 nm) sécrétées par n’importe quelle cellule et jouent un rôle clé dans la communication de cellule à cellule en livrant leur cargaison. Ils contiennent une variété de biomolécules actives qui peuvent inclure des acides nucléiques, des facteurs de croissance ou des lipides bioactifs1. Pour ces raisons, les VE ont été évalués pour leur utilisation potentielle dans les thérapies. En termes d’orthopédie et de régénération osseuse, des véhicules électriques de différentes sources ont été testés. Parmi eux, il a été démontré que les VE dérivés de plaquettes induisent un effet de différenciation sur les cellules souches tout en maintenant un faible profil cytotoxique2,3. Par conséquent, d’autres recherches sont nécessaires pour explorer la possibilité de combiner les VE avec des biomatériaux afin de les utiliser dans la pratique clinique quotidienne.
Les biomatériaux à base de titane sont largement utilisés comme échafaudages pour les interventions cliniques de guérison osseuse en raison de leurs propriétés mécaniques, de leur biocompatibilité élevée et de leur durabilité à long terme4. Néanmoins, les implants Ti sont un matériau bioinerte et, par conséquent, présentent une faible capacité de liaison avec le tissu osseux environnant5. Pour cette raison, des modifications du titane sont à l’étude afin d’améliorer leurs performances en réalisant un microenvironnement plus fonctionnel à sa surface4,6,7. En ce sens, les véhicules électriques peuvent être ancrés au titane par des interactions chimiques8 ou physiques9,10. Les VE immobilisés dérivés de cellules souches ou de macrophages améliorent la bioactivité du Ti en favorisant l’adhésion et la prolifération cellulaires, induisant ainsi un effet ostéogénique8,9,10.
Cet article se concentrera sur une stratégie de coulée goutte à goutte pour le revêtement des surfaces Ti avec des véhicules électriques dérivés de PL en détail. De plus, nous évaluerons le profil de libération des VE de la surface revêtue au fil du temps et confirmerons sa biocompatibilité cellulaire in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole vise à fournir des instructions claires pour la fonctionnalisation des véhicules électriques sur les surfaces Ti. La méthode présentée est basée sur une stratégie de coulée de goutte, qui est un type de fonctionnalisation de type physisorption. Il existe une mauvaise bibliographie concernant la fonctionnalisation des VE sur les surfaces Ti, bien qu’il existe peu d’études montrant des avantages différents en immobilisant les VE sur Ti10. Quoi qu’il en soit, certaines d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinancée par le Fonds social européen du FSE et le Fonds européen de développement régional du FEDER (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), et PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financés par la taxe de tourisme durable des îles Baléares.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
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