Thrombozyten-abgeleitete extrazelluläre Vesikelfunktionalisierung von Ti-Implantaten
Summary
Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) vor, die von den Thrombozytenlysaten (PL) abgeleitet sind, und deren Verwendung zur Beschichtung von Titan (Ti) Implantatoberflächen. Wir beschreiben das Drop-Casting-Beschichtungsverfahren, das EVs-Freisetzungsprofil von den Oberflächen und die In-vitro-Biokompatibilität von EVs beschichteten Ti-Oberflächen.
Abstract
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind biologische Nanovesikel, die eine Schlüsselrolle in der Zellkommunikation spielen. Ihr Inhalt umfasst aktive Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren, die ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin darstellen. In jüngerer Zeit haben EVs, die von Thrombozytenlysat (PL) abgeleitet wurden, eine osteogene Fähigkeit gezeigt, die mit PL vergleichbar ist. Außerdem werden Biomaterialien häufig in der Orthopädie oder Zahnrestauration eingesetzt. Hier stellen wir eine Methode zur Funktionalisierung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten EVs zur Verfügung, um ihre osteogenen Eigenschaften zu verbessern.
EVs werden durch Größenausschlusschromatographie von PL isoliert, und anschließend werden Ti-Oberflächen mit PL-EVs durch Drop-Casting funktionalisiert. Die Funktionalisierung wird durch die Freisetzung von EVs und ihre Biokompatibilität durch den Laktatdehydrogenase (LDH) -Freisetzungsassay nachgewiesen.
Introduction
EVs sind Membranvesikel (30-200 nm), die von jeder Zelle sezerniert werden und eine Schlüsselrolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation spielen, indem sie ihre Fracht liefern. Sie enthalten eine Vielzahl von aktiven Biomolekülen, die Nukleinsäuren, Wachstumsfaktoren oder bioaktive Lipide enthalten können1. Aus diesen Gründen wurden EVs auf ihren potenziellen Einsatz in Therapeutika hin untersucht. In Bezug auf Orthopädie und Knochenregeneration wurden EVs aus verschiedenen Quellen getestet. Unter ihnen wurde gezeigt, dass Thrombozyten-abgeleitete EVs einen Differenzierungseffekt auf Stammzellen induzieren und gleichzeitig ein niedriges zytotoxisches Profil beibehalten2,3. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um die Möglichkeit der Kombination von Elektrofahrzeugen mit Biomaterialien zu untersuchen, um sie in der täglichen klinischen Praxis zu verwenden.
Biomaterialien auf Titanbasis werden aufgrund ihrer mechanischen Eigenschaften, ihrer hohen Biokompatibilität und ihrer langfristigen Haltbarkeit häufig als Gerüste für klinische Eingriffe zur Knochenheilung eingesetzt4. Dennoch sind Ti-Implantate ein bioinertes Material und weisen daher eine schlechte Bindungsfähigkeit mit dem umgebenden Knochengewebe auf5. Aus diesem Grund werden Titanmodifikationen untersucht, um ihre Leistung zu verbessern, indem eine funktionellere Mikroumgebung auf ihrer Oberfläche erreicht wird4,6,7. In diesem Sinne können EVs durch chemische8 oder physikalische Wechselwirkungen an Titan verankert werden9,10. Immobilisierte EVs, die aus Stammzellen oder Makrophagen gewonnen werden, verbessern die Bioaktivität von Ti, indem sie die zelluläre Adhäsion und Proliferation fördern und dadurch eine osteogene Wirkung hervorrufen8,9,10.
Dieser Artikel konzentriert sich im Detail auf eine Tropfengussstrategie für die Beschichtung von Ti-Oberflächen mit PL-abgeleiteten Elektrofahrzeugen. Darüber hinaus werden wir das Freisetzungsprofil von Elektrofahrzeugen von der beschichteten Oberfläche im Laufe der Zeit bewerten und seine zelluläre Biokompatibilität in vitro bestätigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll zielt darauf ab, klare Anweisungen für die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen bereitzustellen. Das vorgestellte Verfahren basiert auf einer Tropfengießstrategie, bei der es sich um eine Physisorptionsart der Funktionalisierung handelt. Es gibt eine schlechte Bibliographie in Bezug auf die Funktionalisierung von Elektrofahrzeugen auf Ti-Oberflächen, obwohl es nur wenige Studien gibt, die unterschiedliche Vorteile durch die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf <sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, kofinanziert durch den Europäischen Sozialfonds ESF und den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung EFRE (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), die Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), und PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziert durch die nachhaltige Tourismussteuer der Balearen.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
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