תפקוד ארסיות חוץ-תאית שמקורה בטסיות דם של שתלי Ti
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד של שלל חוץ תאי (EVs) הנגזר טסיות (PL) ואת השימוש בהם עבור ציפוי משטחי שתל טיטניום (Ti). אנו מתארים את שיטת ציפוי יציקת הטיפות, את פרופיל שחרור ה- EVs מהמשטחים, ואת תאימות ביולוגית במבחנה של משטחי Ti מצופים EVs.
Abstract
שלשלות חוץ-תאיות (EVs) הן ננו-ורידים ביולוגיים הממלאים תפקיד מפתח בתקשורת התא. התוכן שלהם כולל ביומולקולים פעילים כגון חלבונים וחומצות גרעין, אשר מציגים פוטנציאל גדול ברפואה רגנרטיבית. לאחרונה, EVs נגזר טסיות ליסאט (PL) הראו יכולת אוסטאוגנית דומה PL. חוץ מזה, ביו-חומרים משמשים לעתים קרובות באורתופדיה או בשיקום שיניים. כאן, אנו מספקים שיטה לפונקציונליזציה משטחי Ti עם PL נגזר EVs על מנת לשפר את המאפיינים האוסטאוגניים שלהם.
EVs מבודדים PL על ידי גודל אי הכללת כרומטוגרפיה, ולאחר מכן משטחי Ti הם פונקציונליים עם PL-EVs על ידי יציקת טיפה. פונקציונליזציה מוכחת על ידי שחרור EVs ואת תאימות ביולוגית שלה על ידי בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז (LDH).
Introduction
רכבים EV הם שלל ממברנה (30-200 ננומטר) המופרשים על ידי כל תא וממלאים תפקיד מפתח בתקשורת בין תאים לתא על ידי אספקת המטען שלהם. הם מכילים מגוון של ביומולקולים פעילים שעשויים לכלול חומצות גרעין, גורמי גדילה, או שומנים ביואקטיביים1. מסיבות אלה, EVs הוערכו לשימוש הפוטנציאלי שלהם טיפולית. במונחים של אורתופדיה והתחדשות עצם, נבדקו EVs ממקורות שונים. ביניהם, הוכח כי EVs שמקורם בטסיות דם גורם להשפעת בידול על תאי גזע תוך שמירה על פרופיל ציטוטוקסי נמוך2,3. לכן, דרוש מחקר נוסף כדי לבחון את האפשרות של שילוב EVs עם biomaterials על מנת להשתמש בהם בפועל קליני יומי.
ביו-חומרים מבוססי טיטניום נמצאים בשימוש נרחב כפיגומים להתערבויות קליניות לריפוי עצמות בשל תכונותיהם המכניות, תאימות ביולוגית גבוהה ועמידות ארוכת טווח4. עם זאת, שתלי Ti הם חומר ביו-אינרטי, ולכן הם מציגים יכולת ירודה להתחברות עם רקמת העצם שמסביב5. מסיבה זו, שינויים טיטניום נחקרים על מנת לשפר את הביצועים שלהם על ידי השגת microenvironment פונקציונלי יותר על פני השטח שלה 4,6,7. במובן זה, EVs יכול להיות מעוגן טיטניום על ידי כימי8 או אינטראקציות פיזיות9,10. רכבים חשמליים משותקים המופקים מתאי גזע או מקרופאגים משפרים את הביואקטיביות של Ti על ידי קידום הידבקות והתפשטות תאית ובכך לגרום לאפקט אוסטאוגני8,9,10.
מאמר זה יתמקד באסטרטגיית יציקת טיפה לציפוי משטחי Ti עם EVs שמקורם ב- PL בפירוט. בנוסף, אנו נעריך פרופיל שחרור EVs מהמשטח המצולף לאורך זמן ונאשר את תאימות הביולוגית התאית שלה במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה נועד לספק הוראות ברורות לפונקציונליזציה של EVs על משטחי Ti. השיטה המוצגת מבוססת על אסטרטגיית יציקת טיפה, שהיא סוג של פונקציונליזציה. ביבליוגרפיה גרועה קיימת לגבי פונקציונליזציה של רכבים אלקטרוניים על משטחי Ti, אם כי ישנם מחקרים מעטים המראים יתרונות שונים על ידי שתק רכבים אלקטרונ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכון לסאלוד קרלוס השלישי, שר הכלכלה y Competitividad, במימון משותף של הקרן החברתית האירופית ESF והקרן לפיתוח אזורי אירופי ERDF (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), דירצ’יו ג’נרל ד’חקירות, קונסלריה ד’חקירות, שלטון באלאר (FPI/2046/2017) ו- PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, לפרש את סאלוד, ג’נראנדו ואלור (JUNIOR01/18), הממומן על ידי מס התיירות בת קיימא של האיים הבלאריים.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
