प्लेटलेट-व्युत्पन्न बाह्य कोशिकीय पुटिका Ti प्रत्यारोपण के Functionalization
Summary
यहां, हम प्लेटलेट लिसेट (पीएल) से व्युत्पन्न एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) के अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और टाइटेनियम (टीआई) प्रत्यारोपण सतहों को कोटिंग करने के लिए उनके उपयोग करते हैं। हम ड्रॉप कास्टिंग कोटिंग विधि का वर्णन करते हैं, सतहों से ईवी एस रिलीज प्रोफ़ाइल, और ईवी लेपित टीआई सतहों के इन विट्रो बायोकॉम्पैटिबिलिटी।
Abstract
एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) जैविक नैनोवेसिकल्स हैं जो सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनकी सामग्री में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जैसे सक्रिय बायोमोलेक्यूल्स शामिल हैं, जो पुनर्योजी चिकित्सा में बड़ी क्षमता प्रस्तुत करते हैं। हाल ही में, प्लेटलेट लिसेट (पीएल) से व्युत्पन्न ईवी ने पीएल के तुलनीय एक ओस्टियोजेनिक क्षमता दिखाई है। इसके अलावा, बायोमैटेरियल्स का उपयोग अक्सर ऑर्थोपेडिक्स या दंत बहाली में किया जाता है। यहां, हम उनके ऑस्टियोजेनिक गुणों में सुधार करने के लिए पीएल-व्युत्पन्न ईवी के साथ टीआई सतहों को कार्यात्मक बनाने के लिए एक विधि प्रदान करते हैं।
ईवी को आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा पीएल से अलग किया जाता है, और बाद में टीआई सतहों को ड्रॉप कास्टिंग द्वारा पीएल-ईवी के साथ कार्यात्मक किया जाता है। Functionalization ईवीएस रिलीज और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच) रिलीज परख द्वारा इसकी biocompatibility द्वारा साबित होता है.
Introduction
ईवी किसी भी सेल द्वारा स्रावित झिल्ली पुटिकाएं (30-200 एनएम) हैं और अपने कार्गो को वितरित करके सेल-टू-सेल संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। उनमें विभिन्न प्रकार के सक्रिय बायोमोलेक्यूल्स होते हैं जिनमें न्यूक्लिक एसिड, विकास कारक, या बायोएक्टिव लिपिड शामिल हो सकते हैं1। इन कारणों से, ईवी का मूल्यांकन चिकित्सीय में उनके संभावित उपयोग के लिए किया गया है। ऑर्थोपेडिक्स और हड्डी के उत्थान के संदर्भ में, विभिन्न स्रोतों से ईवी का परीक्षण किया गया है। उनमें से, प्लेटलेट-व्युत्पन्न ईवी को कम साइटोटॉक्सिक प्रोफाइल 2,3 को बनाए रखते हुए स्टेम कोशिकाओं पर एक भेदभाव प्रभाव को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, दैनिक नैदानिक अभ्यास में उनका उपयोग करने के लिए बायोमैटेरियल्स के साथ ईवी के संयोजन की संभावना का पता लगाने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है।
टाइटेनियम आधारित biomaterials व्यापक रूप से उनके यांत्रिक गुणों, उच्च biocompatibility, और दीर्घकालिक स्थायित्व के कारण हड्डी चिकित्सा नैदानिक हस्तक्षेप के लिए scaffolds के रूप में उपयोग किया जाता है4. फिर भी, टीआई प्रत्यारोपण एक बायोइनर्ट सामग्री हैं और इसलिए, आसपास की हड्डी के ऊतकों के साथ बंधन के लिए एक खराब क्षमता पेश करते हैं5। इस कारण से, टाइटेनियम संशोधनों का अध्ययन किया जा रहा है ताकि इसकी सतह 4,6,7 पर अधिक कार्यात्मक माइक्रोएन्वायरमेंट प्राप्त करके उनके प्रदर्शन में सुधार किया जा सके। इस अर्थ में, ईवी को रासायनिक 8 या भौतिक इंटरैक्शन 9,10 द्वारा टाइटेनियम में लंगर डाला जा सकता है। स्टेम कोशिकाओं या मैक्रोफेज से व्युत्पन्न स्थिर ईवी सेलुलर आसंजन और प्रसार को बढ़ावा देकर टीआई की जैव सक्रियता को बढ़ाते हैं जिससे एक ओस्टियोजेनिक प्रभाव 8,9,10 उत्प्रेरण होता है।
यह लेख विस्तार से पीएल-व्युत्पन्न ईवी के साथ टीआई सतहों को कोटिंग करने के लिए एक ड्रॉप कास्टिंग रणनीति पर ध्यान केंद्रित करेगा। इसके अलावा, हम समय के साथ लेपित सतह से ईवी रिलीज प्रोफाइल का मूल्यांकन करेंगे और विट्रो में इसकी सेलुलर बायोकॉम्पैटिबिलिटी की पुष्टि करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य Ti सतहों पर EVs functionalization के लिए स्पष्ट निर्देश प्रदान करना है। प्रस्तुत विधि एक ड्रॉप कास्टिंग रणनीति पर आधारित है, जो कार्यात्मकता का एक भौतिक शोषण प्रकार है। खराब ग्रंथ सूची टीआई ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को Instituto de Salud कार्लोस III, Ministerio de Economía y Competitividad द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो ESF यूरोपीय सामाजिक कोष और ERDF यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (MS16/00124) द्वारा सह-वित्त पोषित था; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), और PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), बैलेरिक द्वीप समूह के टिकाऊ पर्यटन कर द्वारा वित्त पोषित।
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
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