Funzionalizzazione delle vescicole extracellulari di derivazione piastrinica degli impianti Ti
Summary
Qui presentiamo un metodo per l’isolamento delle vescicole extracellulari (EV) derivate dai lisati piastrinici (PL) e il loro uso per il rivestimento delle superfici implantari in titanio (Ti). Descriviamo il metodo di rivestimento drop casting, il profilo di rilascio EV dalle superfici e la biocompatibilità in vitro delle superfici Ti rivestite con EV.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono nanovescicole biologiche che svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellulare. Il loro contenuto include biomolecole attive come proteine e acidi nucleici, che presentano un grande potenziale nella medicina rigenerativa. Più recentemente, i veicoli elettrici derivati dal lisato piastrinico (PL) hanno mostrato una capacità osteogenica paragonabile alla PL. Inoltre, i biomateriali sono spesso utilizzati in ortopedia o restauro dentale. Qui, forniamo un metodo per funzionalizzare le superfici Ti con EV derivati da PL al fine di migliorare le loro proprietà osteogeniche.
I veicoli elettrici sono isolati dal PL mediante cromatografia di esclusione dimensionale e successivamente le superfici Ti vengono funzionalizzate con PL-EV mediante drop casting. La funzionalizzazione è dimostrata dal rilascio di veicoli elettrici e dalla sua biocompatibilità mediante il test di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH).
Introduction
I veicoli elettrici sono vescicole di membrana (30-200 nm) secrete da qualsiasi cellula e svolgono un ruolo chiave nella comunicazione cellula-cellula consegnando il loro carico. Contengono una varietà di biomolecole attive che possono includere acidi nucleici, fattori di crescita o lipidi bioattivi1. Per questi motivi, i veicoli elettrici sono stati valutati per il loro potenziale utilizzo in terapia. In termini di ortopedia e rigenerazione ossea, sono stati testati veicoli elettrici provenienti da diverse fonti. Tra questi, è stato dimostrato che i veicoli elettrici derivati dalle piastrine inducono un effetto di differenziazione sulle cellule staminali mantenendo un basso profilo citotossico2,3. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare la possibilità di combinare i veicoli elettrici con i biomateriali al fine di utilizzarli nella pratica clinica quotidiana.
I biomateriali a base di titanio sono ampiamente utilizzati come scaffold per interventi clinici di guarigione ossea grazie alle loro proprietà meccaniche, all’elevata biocompatibilità e alla durata a lungo termine4. Tuttavia, gli impianti Ti sono un materiale bioinerte e, pertanto, presentano una scarsa capacità di legame con il tessuto osseo circostante5. Per questo motivo, le modifiche del titanio sono in fase di studio al fine di migliorare le loro prestazioni ottenendo un microambiente più funzionale sulla sua superficie4,6,7. In questo senso, i veicoli elettrici possono essere ancorati al titanio da interazioni chimiche8 o fisiche9,10. Gli EV immobilizzati derivati da cellule staminali o macrofagi migliorano la bioattività di Ti promuovendo l’adesione e la proliferazione cellulare inducendo così un effetto osteogenico8,9,10.
Questo articolo si concentrerà su una strategia di drop casting per il rivestimento di superfici Ti con veicoli elettrici derivati da PL in dettaglio. Inoltre, valuteremo il profilo di rilascio dei veicoli elettrici dalla superficie rivestita nel tempo e confermeremo la sua biocompatibilità cellulare in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo mira a fornire istruzioni chiare per la funzionalizzazione dei veicoli elettrici sulle superfici Ti. Il metodo presentato si basa su una strategia di drop casting, che è un tipo di funzionalizzazione di fisisorbimento. Esiste una scarsa bibliografia per quanto riguarda la funzionalizzazione dei veicoli elettrici sulle superfici Ti, anche se ci sono pochi studi che mostrano diversi vantaggi immobilizzando i veicoli elettrici su Ti10. Ad ogni modo, alcune delle strategie esplorate…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dall’Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, cofinanziato dal Fondo sociale europeo del FSE e dal Fondo europeo di sviluppo regionale del FESR (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), la Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017), e PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finanziato dalla tassa sul turismo sostenibile delle Isole Baleari.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
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