티 임플란트의 혈소판 유래 세포 외 소포 기능화
Summary
여기서, 우리는 혈소판 용해 (PL)에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 티타늄(Ti) 임플란트 표면코팅에 대한 이들의 사용에 대한 방법을 제시한다. 우리는 낙하 주조 코팅 방법, 표면에서 의 EV 방출 프로파일, 그리고 티 표면 코팅 된 전기 EV의 생체 내 생체 적합성을 설명합니다.
Abstract
세포 외 소포 (EV)는 세포 통신에서 중요한 역할을 하는 생물학적 나노 채소입니다. 그들의 함량은 재생 의학에 있는 중대한 잠재력을 제시하는 단백질 과 핵산과 같은 적극적인 생체 분자를 포함합니다. 최근에는 혈소판 리사테(PL)에서 추출한 전기자동차가 PL에 필적하는 골성 능력을 보여주었다. 게다가, 생체 재료는 정형 외과 또는 치과 복원에 자주 사용됩니다. 여기서는 골성 특성을 향상시키기 위해 PL 유래 EV로 Ti 표면을 기능화하는 방법을 제공합니다.
EV는 크기 제외 크로마토그래피에 의해 PL에서 분리되며, 그 후 Ti 표면은 드롭 캐스팅에 의해 PL-EV로 기능화됩니다. 기능화는 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출 분석서에 의해 EV 방출 및 생체 적합성에 의해 입증된다.
Introduction
전기자동차는 모든 세포에 의해 분비되는 멤브레인 소포(30-200 nm)이며 화물을 전달함으로써 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 그(것)들은 핵산, 성장 인자, 또는 생리활성 지질1을 포함할 수 있는 액티브한 생체 분자의 각종을 포함합니다. 이러한 이유로, EV치료에서 그들의 잠재적인 사용에 대 한 평가 되었습니다. 정형 외과 및 뼈 재생의 관점에서, 다른 소스에서 전기 테스트 되었습니다. 그 중에서도 혈소판 유래 전기는 낮은 세포독성 프로파일2,3을 유지하면서 줄기 세포에 대한 분화 효과를 유도하는 것으로 나타났다. 따라서, 매일 임상 실습에서 이를 사용하기 위해서는 전기자동차와 생체재료의 결합 가능성을 탐구하기 위한 추가 연구가 필요하다.
티타늄 기반 생체 재료는 기계적 특성, 높은 생체 적합성 및 장기 내구성으로 인해 뼈 치유 임상 개입을위한 발판으로 널리 사용됩니다4. 그럼에도 불구하고, Ti 임플란트는 생물활성 물질이므로 주변 뼈 조직5와 결합할 수 있는 능력이 좋지 않습니다. 이러한 이유로, 티타늄 수정은 표면에 보다 기능적인 마이크로 환경을 달성하여 성능을 향상시키기 위해 연구되고있다4,6,7. 이러한 의미에서, 전기자동차는 화학8 또는 물리적 상호작용에 의해 티타늄에 고정될 수 있다9,10. 줄기 세포 또는 대식세포로부터 유래된 고정된 전기는 세포 접착 및 증식을 촉진하여 Ti의 생체 활성을 향상시켜 골성 효과를 유도합니다8,9,10.
이 문서는 PL 유래 EV로 Ti 표면을 코팅하기위한 드롭 캐스팅 전략에 중점을 둡니다. 또한, 우리는 시간이 지남에 따라 코팅 된 표면에서 EV 방출 프로파일을 평가하고 체외에서 세포 생체 적합성을 확인합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 TI 표면에 EV 기능화에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로합니다. 제시된 방법은 기능화의 물리작용 형인 낙하 주조 전략을 기반으로 한다. Ti 표면에 대한 EV 기능화에 관한 불쌍한 참고 문헌이 존재하지만 Ti10에서 EV를 고정하여 다른 이점을 보여주는 연구는 거의 없습니다. 어쨌든, 탐구된 전략의 몇몇은 생화학적 결합8, 중합체 함정<sup cla…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 INstituto 드 살루드 카를로스 III, 장관 드 Economía y Competitividad에 의해 투자되었다, ESF 유럽 사회 기금과 ERDF 유럽 지역 개발 기금에 의해 공동 투자 (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), 디레치오 제너럴 디Investigació, 콘셀러티아 d’Investigació, 지배 발레어 (FPI/2046/2017), 그리고 PROGRAMA 주니어 델 프로젝트 탤런트 플러스, construyendo SALUD, 제네란도 VALOR (주니어01/18), 지속 가능한 관광 에 의해 금융.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
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