Blodplate-avledet ekstracellulær vesicle funksjonalisering av Ti implantater
Summary
Her presenterer vi en metode for isolering av Extracellular Vesicles (EVs) avledet fra blodplatelysene (PL) og deres bruk for belegg titan (Ti) implantatoverflater. Vi beskriver dråpestøpebeleggmetoden, ELBIL-ene frigjør profil fra overflatene, og in vitro biokompatibilitet av elbiler belagte Ti-overflater.
Abstract
Ekstracellulære Vesicles (ELBILER) er biologiske nanovesikler som spiller en nøkkelrolle i cellekommunikasjon. Innholdet inkluderer aktive biomolekyler som proteiner og nukleinsyrer, som gir stort potensial i regenerativ medisin. Mer nylig har elbiler avledet fra Platelet Lysate (PL) vist en osteogen evne som kan sammenlignes med PL. Dessuten brukes biomaterialer ofte i ortopedi eller tannrestaurering. Her tilbyr vi en metode for å funksjonalisere Ti-overflater med PL-avledede elbiler for å forbedre deres osteogene egenskaper.
Elbiler er isolert fra PL etter størrelseseksklusjonskromatografi, og etterpå er Ti-overflater funksjonalisert med PL-elbiler ved drop casting. Funksjonalisering er bevist ved EVs utgivelse og dens biokompatibilitet av laktat dehydrogenase (LDH) utgivelsesanalyse.
Introduction
Elbiler er membran vesicles (30-200 nm) utskilt av enhver celle og spille en nøkkelrolle i celle-til-celle kommunikasjon ved å levere sin last. De inneholder en rekke aktive biomolekyler som kan omfatte nukleinsyrer, vekstfaktorer eller bioaktive lipider1. Av disse grunnene har elbiler blitt evaluert for deres potensielle bruk i terapeutiske behandlinger. Når det gjelder ortopedi og benregenerering, har elbiler fra forskjellige kilder blitt testet. Blant dem har blodplater-avledede elbiler vist seg å indusere en differensieringseffekt på stamceller samtidig som de opprettholder en lav cytotoksisk profil2,3. Derfor er det nødvendig med videre forskning for å utforske muligheten for å kombinere elbiler med biomaterialer for å kunne bruke dem i daglig klinisk praksis.
Titanbaserte biomaterialer er mye brukt som stillaser for beinheling kliniske intervensjoner på grunn av deres mekaniske egenskaper, høy biokompatibilitet og langsiktig holdbarhet4. Likevel er Ti-implantater et bioinert materiale og presenterer derfor en dårlig evne til å binde seg til det omkringliggende beinvevet5. Av denne grunn studeres titanmodifikasjoner for å forbedre ytelsen ved å oppnå et mer funksjonelt mikromiljø på overflaten4,6,7. I denne forstand kan elbiler forankres til titan ved kjemisk8 eller fysiske interaksjoner9,10. Immobiliserte elbiler avledet fra stamceller eller makrofager forbedrer bioaktiviteten til Ti ved å fremme cellulær vedheft og spredning og dermed indusere en osteogen effekt8,9,10.
Denne artikkelen vil fokusere på en drop casting strategi for belegg Ti overflater med PL-avledede elbiler i detalj. I tillegg vil vi evaluere EVs utgivelsesprofil fra den belagte overflaten over tid og bekrefte dens cellulære biokompatibilitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen tar sikte på å gi klare instruksjoner for EVs funksjonalisering på Ti overflater. Metoden som presenteres er basert på en drop casting-strategi, som er en fyseorpsjonstype funksjonalisering. Det finnes dårlig bibliografi når det gjelder EVs funksjonalisering på Ti-overflater, selv om det er få studier som viser forskjellige fordeler ved å immobilisere elbiler på Ti10. Uansett inkluderer noen av strategiene som utforskes biokjemisk binding8, polym…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble finansiert av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, finansiert av ESF European Social Fund og ERDF European Regional Development Fund (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) og PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansiert av den bærekraftige turistskatten på Balearene.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
