Тромбоцитарные внеклеточные везикулы функционализация Ti имплантатов
Summary
Здесь мы представляем метод выделения внеклеточных везикул (EV), полученных из лизатов тромбоцитов (PL), и их использование для покрытия титановых (Ti) поверхностей имплантатов. Мы описываем метод капельного литья, профиль высвобождения EV с поверхностей и биосовместимость in vitro поверхностей EV, покрытых Ti.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EV) являются биологическими нановезикулами, которые играют ключевую роль в клеточной коммуникации. Их содержание включает активные биомолекулы, такие как белки и нуклеиновые кислоты, которые представляют большой потенциал в регенеративной медицине. Совсем недавно EV, полученные из лизата тромбоцитов (PL), показали остеогенную способность, сравнимую с PL. Кроме того, биоматериалы часто используются в ортопедии или реставрации зубов. Здесь мы предлагаем метод функционализации ti-поверхностей с помощью ЭЛЕКТРОМОБИЛей, полученных из PL, с целью улучшения их остеогенных свойств.
Электромобили выделяются из PL с помощью хроматографии исключения размеров, а затем ti-поверхности функционализируются PL-EV путем капельного литья. Функционализация доказана высвобождением EV и его биосовместимостью с помощью анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH).
Introduction
EV представляют собой мембранные везикулы (30-200 нм), секретируемые любой клеткой и играющие ключевую роль в межклеточной коммуникации, доставляя свой груз. Они содержат различные активные биомолекулы, которые могут включать нуклеиновые кислоты, факторы роста или биологически активные липиды1. По этим причинам электромобили были оценены на предмет их потенциального использования в терапии. С точки зрения ортопедии и регенерации костей, были протестированы электромобили из разных источников. Среди них было показано, что тромбоцитарные EV индуцируют дифференцировочный эффект на стволовые клетки при сохранении низкого цитотоксического профиля2,3. Поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения возможности сочетания EV с биоматериалами с целью их использования в повседневной клинической практике.
Биоматериалы на основе титана широко используются в качестве каркасов для клинических вмешательств по заживлению костей из-за их механических свойств, высокой биосовместимости и долговечности4. Тем не менее, имплантаты Ti являются биоинертным материалом и, следовательно, обладают плохой способностью связываться с окружающей костной тканью5. По этой причине изучаются модификации титана с целью улучшения их характеристик за счет достижения более функционального микросреды на его поверхности4,6,7. В этом смысле электромобили могут быть привязаны к титану химическими8 или физическими взаимодействиями9,10. Иммобилизованные EV, полученные из стволовых клеток или макрофагов, повышают биоактивность Ti, способствуя клеточной адгезии и пролиферации, тем самым вызывая остеогенный эффект8,9,10.
Эта статья будет подробно посвящена стратегии капельного литья для покрытия поверхностей Ti электромобилями, полученными из PL. Кроме того, мы оценим профиль высвобождения электромобилей с поверхности покрытия с течением времени и подтвердим его клеточную биосовместимость in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол направлен на предоставление четких инструкций по функционализации электромобилей на поверхностях Ti. Представленный метод основан на стратегии капельного литья, которая является физисорбционным типом функционализации. Существует плохая библиография в отношении функц?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось Институтом спасения Карлоса III, Министерством экономики и конкуренции, совместно финансируемым Европейским социальным фондом ESF и Европейским фондом регионального развития ERDF (MS16/00124; СР16/00124; PI17/01605), Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) и PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), финансируемые за счет налога на устойчивый туризм Балеарских островов.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
