Trombocyt-härledd extracellulär vesicle funktionalisering av Ti-implantat
Summary
Här presenterar vi en metod för isolering av extracellulära vesicles (EVs) som härrör från trombocyt lysates (PL) och deras användning för beläggning titan (Ti) implantat ytor. Vi beskriver droppgjutningsmetoden, EVs-utlösningsprofilen från ytorna och in vitro-biokompatibiliteten hos EVs belagda Ti-ytor.
Abstract
Extracellulära vesicles (EVs) är biologiska nanovesicles som spelar en nyckelroll i cellkommunikation. Deras innehåll inkluderar aktiva biomolekyler som proteiner och nukleinsyror, som utgör stor potential inom regenerativ medicin. På senare tid har EVs som härrör från Trombocyt lysate (PL) visat en osteogen förmåga jämförbar med PL. Dessutom används biomaterial ofta i ortopedi eller tandåterställning. Här tillhandahåller vi en metod för att funktionalisera Ti-ytor med PL-härledda EVs för att förbättra deras osteogena egenskaper.
EVs isoleras från PL efter storlek exkludering kromatografi, och efteråt Ti ytor är funktionella med PL-EVs genom droppgjutning. Funktionalisering bevisas av EVs release och dess biokompatibilitet genom laktat dehydrogenas (LDH) release assay.
Introduction
EVs är membranblåsor (30-200 nm) som utsöndras av alla celler och spelar en nyckelroll i cell-till-cell-kommunikation genom att leverera sin last. De innehåller en mängd aktiva biomolekyler som kan inkludera nukleinsyror, tillväxtfaktorer eller bioaktiva lipider1. Av dessa skäl har EVs utvärderats för deras potentiella användning i terapier. När det gäller ortopedi och benregenerering har EVs från olika källor testats. Bland dem har trombocyt-härledda EVs visat sig inducera en differentieringseffekt på stamceller samtidigt som en låg cytotoxisk profil2,3 bibehålls. Därför krävs ytterligare forskning för att undersöka möjligheten att kombinera EVs med biomaterial för att använda dem i daglig klinisk praxis.
Titanbaserade biomaterial används ofta som byggnadsställningar för benläkande kliniska ingrepp på grund av deras mekaniska egenskaper, hög biokompatibilitet och långsiktig hållbarhet4. Ändå är Ti-implantat ett bioinertmaterial och utgör därför en dålig förmåga att binda sig med den omgivande benvävnaden5. Av denna anledning studeras titanmodifieringar för att förbättra deras prestanda genom att uppnå en mer funktionell mikromiljö på dess yta4,6,7. I den meningen kan EVs förankras i titan genom kemiska8 eller fysiska interaktioner9,10. Immobiliserade EVs som härrör från stamceller eller makrofager förbättrar tis bioaktivitet genom att främja cellulär vidhäftning och spridning och därigenom inducera en osteogen effekt8,9,10.
Denna artikel kommer att fokusera på en droppgjutningsstrategi för beläggning av Ti-ytor med PL-härledda EVs i detalj. Dessutom kommer vi att utvärdera EVs-releaseprofil från den belagda ytan över tid och bekräfta dess cellulära biokompatibilitet in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll syftar till att ge tydliga instruktioner för EVs-funktionalisering på Ti-ytor. Metoden som presenteras är baserad på en drop casting strategi, som är en fysisorption typ av funktionalisering. Dålig bibliografi finns när det gäller EVs funktionalisering på Ti-ytor, även om det finns få studier som visar olika fördelar genom att immobilisera EVs på Ti10. Hur som helst, några av de strategier som utforskas inkluderar biokemisk bindning8, polymera<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, medfinansierad av ESF:s socialfond och Erufs Europeiska regionala utvecklingsfond (MS16/00124; CP16/00124; PI17/01605), Direcció General d’Investigació, Conselleria d’Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017) och PROGRAMA JUNIOR del projecte TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), finansierad av balearernas hållbara turistskatt.
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
