Tiインプラントの血小板由来細胞外小胞機能化
Summary
ここでは、血小板リセート(PL)に由来する細胞外小胞(EV)の分離方法と、チタン(Ti)の被覆用表面の使用について説明する。落下鋳造コーティング法、表面からのEV放出プロファイル、およびTi表面にコーティングされたEVの インビトロ 生体適合性について述べています。
Abstract
細胞外小胞(EV)は、細胞通信において重要な役割を果たす生物学的ナノ胞である。その含有量には、タンパク質や核酸などの活性生体分子が含まれており、再生医療に大きな可能性を秘めています。最近では、血小板リセート(PL)に由来するEVは、PLに匹敵する骨形成能力を示している。また、生体材料は整形外科や歯科修復に頻繁に使用されます。ここでは、Ti表面をPL由来のEVで機能化し、骨形成特性を改善する方法を提供します。
EVはサイズ排除クロマトグラフィーによりPLから分離され、その後Tiサーフェスはドロップ鋳造によってPL-EVで機能化されます。機能性は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出アッセイによるEV放出およびその生体適合性によって証明される。
Introduction
EVは、あらゆる細胞によって分泌される膜小胞(30-200nm)であり、貨物を運んで細胞間通信において重要な役割を果たします。それらは核酸、成長因子、または生理活性脂質1を含み得るさまざまな活性生体分子を含んでいる。これらの理由から、EVは治療における潜在的な使用について評価されています。整形外科と骨再生の面では、異なるソースからのEVがテストされています。その中でも、血小板由来のEVは、低細胞傷害性プロファイル2,3を維持しながら幹細胞に分化効果を誘導することが示されている。そこで、EVとバイオマテリアルを組み合わせて日常的に臨床現場で使用する可能性を探る研究が必要です。
チタン系生体材料は、機械的特性、高い生体適合性、および長期耐久性に起因する骨治癒の臨床介入のための足場として広く使用されています。それにもかかわらず、Tiインプラントはバイオイナート材料であり、したがって、周囲の骨組織5との結合のための能力が乏しい存在である。このため、チタンの改質は、その表面上のより機能的な微小環境を達成することによって性能を向上させるために研究されている。この意味で、EVは、化学的な8または物理的な相互作用9,10によってチタンに固定することができます。幹細胞またはマクロファージに由来する固定化されたEVは、細胞接着および増殖を促進することにより、Tiの生物活性を高め、それによって骨形成効果8,9,10を誘導する。
本稿では、TI表面にPL由来のEVを塗布するためのドロップ鋳造戦略を詳しく説明します。また、経時に被覆表面からのEV放出プロファイルを評価し、その細胞の生体適合性を インビトロで確認します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、TiサーフェスにEVの機能化のための明確な指示を提供することを目的としています。提示される方法は、機能化の物理タイプであるドロップ鋳造戦略に基づいています。Ti表面上のEV機能化に関する貧弱な文献目録は存在するが、Ti10上にEVを固定化することによって異なる利点を示す研究はほとんどない。とにかく、探求される戦略のいくつかは、生化学?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ESF欧州社会基金とERDF欧州地域開発基金(MS16/00124)が共同出資する、インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世、エコノミア・イ・コンペティビビダード大臣(MS16/00124;CP16/00124;PI17/01605)、ディレッキオ将軍デインベスティガシオ、コンセラーシア・デインベスティガシオ、ガバナー・バレア(FPI/2046/2017)、プログラムAジュニア・デル・プロジェクター・タレントプラス、コンストライェルド・サルード、ジェネランド・ヴァロル(ジュニア01/18)、ベイルレス諸島の持続可能な観光税によって資金提供。
Materials
| 0,8 µm syringe filter | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1mL syringe | BD | 303174 | |
| 96-well culture plate | SPL life sciences | PLC30096 | |
| Absolut ethanol | Scharlau | ET0006005P | Used to prepare 20 % ethanol with Milli-Q® water |
| AKTA purifier System | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coutler | 392934 | SX4750A swinging rotor |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 rotor |
| Conical Tube, Conical Bottom, 50ml | SPL life sciences | PLC50050 | |
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche | 11644793001 | |
| Disposable Syringes 10 ml | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM Low Glucose Glutamax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm syringe filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | Precast columns |
| human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC) | IdISBa Biobank | ||
| Nanodrop 2000 spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis | Malvern | NS300 | Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS |
| Needle | Terumo | 946077135 | |
| Nitric acid 69,5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti Rotor |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100X | Biowest | L0022 | |
| pH Test strips 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| Platelet Lysate (PL) | IdISBa Biobank | Obtained from buffy coats discarded after blood donation | |
| Polypropylene centrifuge tubs | Beckman Coutler | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print | Sarstedt | 62554502 | |
| Sodium hidroxide | Sharlau | SO04251000 | |
| Titanium implants replicas | Implantmedia, SA | NA | Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm |
| Trypsin-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| Tryton X100 | Sigma | T8787 |
Referências
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590 (2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725 (2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694 (2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571 (2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541 (2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
