Análise de escarro controlada pela qualidade por citometria de fluxo

Summary

Este protocolo descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular e a subsequente caracterização de subconjuntos celulares em plataformas citométricas de fluxo padrão.

Abstract

O sputum, amplamente utilizado para estudar o conteúdo celular e outras características microambientais para entender a saúde do pulmão, é tradicionalmente analisado por meio de metodologias baseadas em citologia. Sua utilidade é limitada porque a leitura dos slides é demorada e requer pessoal altamente especializado. Além disso, detritos extensos e a presença de muitas células epiteliais escamosas (SECs), ou células da bochecha, muitas vezes torna uma amostra inadequada para o diagnóstico. Em contraste, a citometria de fluxo permite fenotipagem de alto rendimento de populações celulares, excluindo simultaneamente detritos e SECs.

O protocolo aqui apresentado descreve um método eficiente para dissociar a escarro em uma única suspensão celular, mancha de anticorpos e fixar populações celulares, e adquirir amostras em uma plataforma citométrica de fluxo. Uma estratégia de gating que descreve a exclusão de detritos, células mortas (incluindo SECs) e doublets de células é apresentada aqui. Além disso, este trabalho também explica como analisar células de escarro única viáveis baseadas em um aglomerado de diferenciação (CD)45 populações positivas e negativas para caracterizar subconjuntos de linhagem hematopoiética e epitelial. Uma medida de controle de qualidade também é fornecida pela identificação de macrófagos específicos do pulmão como evidência de que uma amostra é derivada do pulmão e não é saliva. Finalmente, foi demonstrado que este método pode ser aplicado a diferentes plataformas citométricas, fornecendo perfis de escarro do mesmo paciente analisado em três citómetros de fluxo; Navios EX, LSR II e Lyric. Além disso, este protocolo pode ser modificado para incluir marcadores celulares adicionais de interesse. Um método para analisar uma amostra de escarro inteira em uma plataforma citométrica de fluxo é apresentado aqui que torna a escarro favorável para o desenvolvimento de diagnósticos de alta produtividade de doenças pulmonares.

Introduction

Os avanços técnicos no hardware e software de citómetros de fluxo permitiram identificar muitas populações celulares distintas simultaneamente1,2,3,4. A utilização do citómetro de fluxo na pesquisa de células hematopoiéticas, por exemplo, levou a uma compreensão muito melhor do sistema ^{imunológico2} e da hierarquia celular do sistema hematopoiético5, bem como a distinção diagnóstica de uma infinidade de diferentes cânceres sanguíneos6,7,8. Embora a maioria das células de escarro sejam de origem hematopoiética9,10,11, a citometria de fluxo não tem sido amplamente aplicada à análise de escarro para fins diagnósticos. No entanto, vários estudos sugerem que a avaliação das populações de células imunes na escarro (o subconjunto mais significativo de células) pode ser de grande ajuda no diagnóstico e/ou monitoramento de doenças como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)12,13,14,15. Além disso, a existência de marcadores epiteliais específicos que podem ser usados na citometria de fluxo permite o interrogatório do subconjunto mais significativo de células em escarro, células epiteliais pulmonares.

Além da capacidade de analisar muitas populações celulares distintas de diferentes origens teciduais, um citômetro de fluxo pode avaliar um grande número de células em um período relativamente curto. Em comparação, os tipos de análises cológicas baseadas em slides muitas vezes requerem pessoal e/ou equipamento altamente especializados. Essas análises podem ser intensivas em mão-de-obra, o que leva a apenas uma proporção da amostra de escarro que está sendo ^analisada16.

Três questões críticas limitam o uso generalizado de escarro na citometria de fluxo. A primeira questão diz respeito à coleta de escarro. A saliva é coletada através de uma tosse que expele muco dos pulmões para a cavidade oral, posteriormente cuspindo em um copo de coleta. Uma vez que o muco viaja através da cavidade oral, há uma alta chance de contaminação sec. Essa contaminação complica a análise da amostra, mas o problema é facilmente corrigido em uma plataforma citométrica de fluxo, como mostrado neste estudo.

Nem todo mundo pode produzir escarro espontaneamente; por isso, vários dispositivos foram desenvolvidos para auxiliar na coleta de escarro de forma não ^invasiva17. O nebulizador é um desses dispositivos e tem sido mostrado para produzir amostras de escarro confiáveis18,19,20. Embora o nebulizador seja uma forma muito eficaz de coleta não invasiva, seu uso ainda requer uma configuração em uma instalação médica com pessoal ^{especializado21}. Em contraste, dispositivos portáteis como a flauta pulmonar22,23,24 e o acapella16,25 podem ser usados em casa, pois são muito fáceis de usar. Estes dispositivos de assistência são seguros e econômicos.

Para nós, a acapella deu resultados consistentemente melhores do que a flauta ^pulmonar16 e, portanto, o dispositivo de acapella foi escolhido para coleções de escarro. Uma amostra de coleta de 3 dias foi decidida porque o objetivo principal do uso de escarro é desenvolver um teste de detecção de câncer de ^pulmão16. Foi demonstrado que uma amostra de 3 dias aumenta a probabilidade de detecção de câncer de pulmão em comparação com uma amostra de 1 ou 2 dias26,27,28. No entanto, outros métodos de coleta de escarro podem ser preferíveis para diferentes propósitos. Se um método de coleta de escarro diferente for utilizado do que o descrito aqui, recomenda-se titular cuidadosamente cada anticorpo ou corante usado para análise citométrica de fluxo; muito poucos dados estão disponíveis sobre como diferentes métodos de coleta de escarro afetam as proteínas-alvo para citometria de fluxo.

A segunda questão que amortece o entusiasmo pelo uso de escarro para diagnósticos, principalmente relacionados à citometria de fluxo, é o número de células. O problema é a coleta de células viáveis suficientes para uma análise confiável. Dois estudos demonstraram que amostras de escarro coletadas por métodos não invasivos, com a ajuda de um dispositivo auxiliar, contêm células viáveis suficientes que podem ser utilizadas em diagnóstico clínico ou estudos de ^{pesquisa16,24}. No entanto, nenhum desses estudos abordou a questão dos números celulares relativos à citometria de fluxo.

Para os estudos que formam a base para este protocolo, foram coletadas amostras de escarro de participantes de alto risco para o desenvolvimento de câncer de pulmão seguindo diretrizes institucionais aprovadas para cada local de estudo. Os participantes de alto risco foram definidos entre 55 e 75 anos, tendo fumado 30 anos de embalagem e não ter parado de fumar nos últimos 15 anos. Os pacientes foram mostrados como usar o dispositivo de acapella de acordo com as instruções do ^fabricante29 e coletaram escarro por três dias consecutivos em casa. A amostra foi mantida na geladeira até a última coleta. No último dia de coleta, a amostra foi enviada ao laboratório durante a noite com um pacote frio congelado. As amostras foram processadas em uma única suspensão celular no dia em que foram recebidas. Com este método de coleta de escarro, mais do que suficientes células viáveis são obtidas para uma análise citométrica de fluxo confiável.

Por fim, e relacionado com a emissão anterior do número de células, é a questão de como liberar as células de escarro de seu ambiente mucinoso. Como as células podem ser mantidas viáveis e criar uma única suspensão celular que não obstrua o citómetro de fluxo? Baseado no trabalho inicial de Pizzichini et ^al.30 e Miller et ^al.31, este protocolo descreve um método fácil e confiável para o processamento de escarro em uma única suspensão celular adequada para análise citométrica de fluxo. Este método tem utilizado diretrizes bem estabelecidas na citometria de fluxo32,33,34 para desenvolver uma estratégia eficiente de rotulagem de anticorpos para identificar células hematopoiéticas e epiteliais em escarro e fornecer configurações de instrumentos, medidas de controle de qualidade e diretrizes de análise padronizando a análise de escarro em uma plataforma citométrica de fluxo.

Protocol

Todas as etapas do processamento de escarro são realizadas em um gabinete de segurança biológica com equipamentos de proteção individual adequados. 1. Preparação do reagente antes de iniciar a dissociação do escarro Descongele 1% Paraformaldeído (PFA), 25 mL por amostra no gelo e mantenha frio até o uso.ATENÇÃO: O PFA é tóxico por inalação e contato com a pele. Prepare o fixador de acordo com as instruções do fabricante e congele a -20 °C em alíquotas de 25 m…

Representative Results

Este protocolo foi desenvolvido com um ambiente de laboratório clínico em mente. O foco durante o desenvolvimento do protocolo foi a simplicidade, eficiência e reprodutibilidade. Verificou-se que o passo mais demorado no processamento da escarro era contar as células. Portanto, o protocolo é configurado de tal forma que o processamento de escarro e rotulagem celular possam ser realizados independentemente da contagem celular sem perda de tempo. Uma contagem de células precisa, que ainda é necessária para diluir a…

Discussion

O conteúdo celular da escarro inclui uma grande variedade de células amplas, muitas vezes acompanhadas por muitos ^detritos37. Além disso, a análise da escarro requer um controle de qualidade que confirme que a amostra é coletada do pulmão em vez da cavidade ^oral38. Portanto, não é tão simples analisar a escarro por citometria de fluxo como é para o sangue, por exemplo, que libera uma suspensão celular muito mais limpa e homogênea. Este protocolo abordou todas es…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061