Kvalitetsstyret spytanalyse efter flowcytometri

Summary

Denne protokol beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension og den efterfølgende karakterisering af cellulære delmængder på standard flow cytometriske platforme.

Abstract

Sputum, der i vid udstrækning anvendes til at studere det cellulære indhold og andre mikromiljøfunktioner for at forstå lungens sundhed, analyseres traditionelt ved hjælp af cytologibaserede metoder. Dens nytte er begrænset, fordi læsning af dias er tidskrævende og kræver højt specialiseret personale. Desuden gør omfattende snavs og tilstedeværelsen af for mange pladeformede epitelceller (SECs) eller kindceller ofte en prøve utilstrækkelig til diagnose. I modsætning hertil giver flowcytometri mulighed for fænotyping med høj gennemløb af cellulære populationer, samtidig med at snavs og 2-metri’er udelukkes.

Protokollen præsenteres her beskriver en effektiv metode til at adskille spyt i en enkelt celle suspension, antistof plet og fastsætte cellulære populationer, og erhverve prøver på en flow cytometri platform. En gating strategi, der beskriver udelukkelse af vragrester, døde celler (herunder SECs) og celle doublets præsenteres her. Endvidere forklarer dette arbejde også, hvordan man analyserer levedygtige, enkelte spytceller baseret på en klynge af differentiering (CD)45 positive og negative populationer for at karakterisere hæmatoopoietiske og epitelstrenge subsets. En kvalitetskontrol foranstaltning er også fastsat ved at identificere lunge-specifikke makrofager som bevis for, at en prøve er afledt af lungen og er ikke spyt. Endelig er det blevet påvist, at denne metode kan anvendes på forskellige cytometriske platforme ved at levere spytprofiler fra den samme patient analyseret på tre flowcytometre; Navios EX, LSR II og Lyric. Desuden kan denne protokol ændres til at omfatte yderligere cellulære markører af interesse. En metode til at analysere en hel spytprøve på en flowcytometrisk platform præsenteres her, der gør spyt modtagelig for udvikling af høj-throughput diagnostik af lungesygdom.

Introduction

Tekniske fremskridt inden for hardware og software af flowcytometre har gjort det muligt at identificere mange forskellige cellepopulationer samtidigt1,2,3,4. Udnyttelsen af flowcytometeret i hæmatoopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en langt bedre forståelse af ^{immunsystemet2} og det cellulære hierarki i det hæmatoopoietiske ^system5 samt den diagnostiske sondring af en lang række forskellige blodkræft6,7,8. Selv om de fleste spytceller er af hæmatopoietisk oprindelse9,10,11, flow cytometri har ikke været almindeligt anvendt til spyt analyse til diagnostiske formål. Men, flere undersøgelser tyder på, at evalueringen af immuncellepopulationer i spyt (den mest betydningsfulde delmængde af celler) kan være til stor hjælp i diagnosticering og / eller overvågning af sygdomme som astma og kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL)12,13,14,15. Desuden tillader eksistensen af epitelspecifikke markører, der kan bruges i flowcytometri, forhør af følgende mest betydningsfulde delmængde af celler i spyt, lungeepileleceller.

Ud over evnen til at analysere mange forskellige cellepopulationer af forskellig vævsoprindelse kan et flowcytometer evaluere et stort antal celler på relativt kort tid. Til sammenligning kræver diasbaserede, cytologiske typer analyser ofte højt specialiseret personale og/eller udstyr. Disse analyser kan være arbejdskrævende, hvilket fører til, at kun en del af spytprøven ^analyseres16.

Tre kritiske spørgsmål begrænser den udbredte brug af spyt i flowcytometri. Det første nummer vedrører indsamlingen af spyt. Spyt opsamles gennem en huff hoste, der udviser slim fra lungerne ind i mundhulen, efterfølgende spytte ind i en samling kop. Da slim rejser gennem mundhulen, er der en stor chance for SEC forurening. Denne forurening komplicerer prøveanalysen, men problemet afhjælpes let på en flowcytometrisk platform, som vist i denne undersøgelse.

Ikke alle kan producere spyt spontant; derfor er der udviklet flere enheder til at hjælpe med spytsamlingen på en ikke-invasiv ^måde17. Forstøveren er en sådan anordning og har vist sig at producere pålidelige spytprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en meget effektiv måde at ikke-invasivt indsamling spyt, dens anvendelse stadig kræver en indstilling på en medicinsk facilitet med specialiseret ^personale21. I modsætning hertil kan håndholdte enheder som lungefløjten22^{, 23,24} og acapella16,25 bruges hjemme, da de er meget brugervenlige. Disse hjælpeenheder er både sikre og omkostningseffektive.

For os gav acapella konsekvent bedre resultater end ^{lungefløjten16}, og derfor er acapella-enheden valgt til spytsamlinger. En 3-dages indsamling prøve blev besluttet, fordi det primære formål med at bruge spyt er at udvikle en lungekræft afsløring ^test16. Det har vist sig, at en 3-dages prøve øger sandsynligheden for lungekræft afsløring i forhold til en 1- eller 2-dages prøve26,27,28. Andre metoder til sputumindsamling kan dog være at foretrække til forskellige formål. Hvis der anvendes en anden spytsamlingsmetode end den, der er beskrevet her, anbefales det omhyggeligt at titrere hvert antistof eller farvestof, der anvendes til flowcytometrianalyse; meget få data er tilgængelige om, hvordan forskellige spyt indsamling metoder påvirker de målrettede proteiner til flow cytometri.

Det andet spørgsmål, der dæmper begejstringen for at bruge spyt til diagnostik, primært relateret til flowcytometri, er cellenummer. Problemet er indsamlingen af tilstrækkelige levedygtige celler til en pålidelig analyse. To undersøgelser viste, at spytprøver indsamlet ved ikke-invasive metoder, ved hjælp af en hjælpeanordning, indeholder nok levedygtige celler, der kan udnyttes i klinisk diagnose eller ^{forskningsundersøgelser16,24}. Ingen af disse undersøgelser omhandlede imidlertid spørgsmålet om celletal vedrørende flowcytometri.

For de undersøgelser, der danner grundlag for denne protokol, sputum prøver blev indsamlet fra deltagere med høj risiko for at udvikle lungekræft efter godkendte institutionelle retningslinjer for hvert studiested. Højrisikodeltagere blev defineret som mellem 55-75 år, efter at have røget 30 pakkeår og ikke har holdt op med at ryge inden for de sidste 15 år. Patienterne blev vist, hvordan man bruger acapella-enheden i henhold til producentens ^{anvisninger29} og indsamlede spyt i tre på hinanden følgende dage derhjemme. Prøven blev opbevaret i køleskabet indtil den sidste samling. På den sidste indsamlingsdag blev prøven sendt til laboratoriet natten over med en frossen kold pakke. Prøverne blev behandlet til en enkelt celle suspension den dag, de blev modtaget. Med denne metode til sputumsamling opnås mere end nok levedygtige celler til en pålidelig flowcytometrisk analyse.

Endelig, og relateret til den tidligere celle nummer spørgsmål, er spørgsmålet om, hvordan man frigiver spytceller fra sin mucinøse miljø. Hvordan kan cellerne holdes levedygtige og skabe en enkelt celle suspension, der ikke tilstopper strømmen cytometer? Baseret på indledende arbejde af Pizzichini et ^al.30 og Miller et ^al.31, beskriver denne protokol en nem og pålidelig metode til spyt behandling i en enkelt celle suspension, der er egnet til flow cytometrisk analyse. Denne metode har anvendt veletablerede retningslinjer i flowcytometri32,33,34 til at udvikle en effektiv antistofmærkningsstrategi til at identificere hæmatopoietiske og epitelceller i spyt og give instrumentindstillinger, kvalitetskontrolforanstaltninger og analyseretningslinjer, der standardiserer spytanalyse på en flowcytometrisk platform.

Protocol

Alle trin i spytbehandlingen udføres i et biologisk sikkerhedsskab med passende personlige værnemidler. 1. Reagens forberedelse før start sputum dissociation Optø 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 mL pr. prøve på is, og hold dig kold, indtil den er i brug.FORSIGTIG: PFA er giftig ved indånding og hudkontakt. Fiksativt forberedes i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, og frysning ved -20 °C i 25 mL aliquots indtil brug. Prøvens vægt tilnærmes og optøs no…

Representative Results

Denne protokol blev udviklet med et klinisk laboratorium indstilling i tankerne. Fokus under udviklingen af protokollen var på enkelhed, effektivitet og reproducerbarhed. Det blev konstateret, at det mest tidskrævende trin i behandlingen af spyt var at tælle cellerne. Derfor er protokollen konfigureret på en sådan måde, at spytbehandling og cellemærkning kan udføres uafhængigt af celletælling uden tidstab. Et nøjagtigt celletal, som stadig er nødvendigt for at fortynde prøven korrekt til en uhindret kørsel,…

Discussion

Det cellulære indhold af spyt omfatter et stort udvalg af vidtrækkende celler, ofte ledsaget af en masse ^snavs37. Derudover kræver spytanalyse en kvalitetskontrol, der bekræfter, at prøven indsamles fra lungen i stedet for ^mundhulen38. Derfor er det ikke så simpelt at analysere spyt ved flowcytometri som det er for blod, for eksempel, hvilket frigiver en meget renere og homogen celleaffjedring. Denne protokol har behandlet alle disse spørgsmål: at give instrumentind…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061