Kwaliteitsgecontroleerde sputumanalyse door flowcytometrie

Summary

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het dissociëren van sputum in een enkele celsuspensie en de daaropvolgende karakterisering van cellulaire subsets op standaard flowcytometrische platforms.

Abstract

Sputum, veel gebruikt om de cellulaire inhoud en andere micro-omgevingskenmerken te bestuderen om de gezondheid van de long te begrijpen, wordt traditioneel geanalyseerd met behulp van cytologie-gebaseerde methodologieën. Het nut ervan is beperkt omdat het lezen van de dia’s tijdrovend is en zeer gespecialiseerd personeel vereist. Bovendien maakt uitgebreid puin en de aanwezigheid van te veel plaveiselepitheelcellen (SECs), of wangcellen, een monster vaak ongeschikt voor diagnose. Flowcytometrie daarentegen maakt fenotypering met hoge doorvoer van cellulaire populaties mogelijk, terwijl tegelijkertijd puin en SECs worden uitgesloten.

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een efficiënte methode om sputum te dissociëren in een enkele celsuspensie, antilichaamkleuring en cellulaire populaties te fixeren en monsters te verkrijgen op een flowcytometrisch platform. Een gating-strategie die de uitsluiting van puin, dode cellen (inclusief SECs) en celdubbelts beschrijft, wordt hier gepresenteerd. Verder legt dit werk ook uit hoe levensvatbare, enkele sputumcellen kunnen worden geanalyseerd op basis van een cluster van differentiatie (CD)45 positieve en negatieve populaties om hematopoëtische en epitheliale afstammingssubsets te karakteriseren. Een kwaliteitscontrolemaatregel wordt ook geleverd door longspecifieke macrofagen te identificeren als bewijs dat een monster is afgeleid van de long en geen speeksel is. Ten slotte is aangetoond dat deze methode kan worden toegepast op verschillende cytometrische platforms door sputumprofielen van dezelfde patiënt te verstrekken die op drie flowcytometers zijn geanalyseerd; Navios EX, LSR II en Lyric. Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd om extra cellulaire markers van belang op te nemen. Een methode om een volledig sputummonster te analyseren op een flowcytometrisch platform wordt hier gepresenteerd dat sputum geschikt maakt voor het ontwikkelen van high-throughput diagnostiek van longziekte.

Introduction

Technische vooruitgang in de hardware en software van flowcytometers heeft het mogelijk gemaakt om veel verschillende celpopulaties tegelijkertijd te identificeren1,2,3,4. Het gebruik van de flowcytometer in hematopoëtisch celonderzoek heeft bijvoorbeeld geleid tot een veel beter begrip van het ^{immuunsysteem2} en de cellulaire hiërarchie van het hematopoëtische ^systeem5, evenals het diagnostische onderscheid van een veelheid aan verschillende bloedkankers6,7,8. Hoewel de meeste sputumcellen van hematopoëtische oorsprong zijn9,10,11, is flowcytometrie niet op grote schaal toegepast op sputumanalyse voor diagnostische doeleinden. Verschillende studies suggereren echter dat de evaluatie van immuuncelpopulaties in sputum (de belangrijkste subset van cellen) van grote hulp kan zijn bij het diagnosticeren en / of monitoren van ziekten zoals astma en chronische obstructieve longziekte (COPD)12,13,14,15. Bovendien maakt het bestaan van epitheliale specifieke markers die kunnen worden gebruikt in flowcytometrie de ondervraging van de volgende belangrijkste subset van cellen in sputum, longepitheelcellen mogelijk.

Naast het vermogen om veel verschillende celpopulaties van verschillende weefseloorsprongen te analyseren, kan een flowcytometer grote aantallen cellen in een relatief korte periode evalueren. Ter vergelijking: op dia’s gebaseerde, cytologische soorten analyses vereisen vaak zeer gespecialiseerd personeel en / of apparatuur. Deze analyses kunnen arbeidsintensief zijn, wat ertoe leidt dat slechts een deel van het sputummonster wordt ^{geanalyseerd16}.

Drie kritieke problemen beperken het wijdverbreide gebruik van sputum in flowcytometrie. Het eerste probleem heeft betrekking op het verzamelen van sputum. Sputum wordt verzameld door middel van een hoest die slijm uit de longen in de mondholte verdrijft en vervolgens in een verzamelbeker spuugt. Omdat het slijm door de mondholte reist, is er een grote kans op SEC-besmetting. Deze verontreiniging bemoeilijkt de monsteranalyse, maar het probleem kan gemakkelijk worden verholpen op een flowcytometrisch platform, zoals blijkt uit deze studie.

Niet iedereen kan spontaan sputum produceren; daarom zijn er verschillende apparaten ontwikkeld om te helpen bij het verzamelen van sputum op een niet-invasieve ^manier17. De vernevelaar is zo’n apparaat en er is aangetoond dat het betrouwbare sputummonsters produceert18,19,20. Hoewel de vernevelaar een zeer effectieve manier is om sputum niet-invasief te verzamelen, vereist het gebruik ervan nog steeds een instelling in een medische faciliteit met gespecialiseerd ^personeel21. Handheld-apparaten zoals de ^{longfluit22,23,24} en de acapella16,25 kunnen daarentegen thuis worden gebruikt omdat ze zeer gebruiksvriendelijk zijn. Deze hulpmiddelen zijn zowel veilig als kosteneffectief.

Voor ons gaf de acapella consistent betere resultaten dan de ^longfluit16, en daarom is het acapella-apparaat gekozen voor sputumcollecties. Er werd besloten tot een 3-daags verzamelmonster omdat het primaire doel voor het gebruik van sputum het ontwikkelen van een ^{longkankerdetectietest16} is. Het is aangetoond dat een 3-daagse steekproef de kans op detectie van longkanker verhoogt in vergelijking met een 1- of 2-daagse steekproef26,27,28. Andere methoden voor het verzamelen van sputum kunnen echter de voorkeur hebben voor verschillende doeleinden. Als een andere sputumverzamelingsmethode wordt gebruikt dan de hier beschreven methode, wordt aanbevolen om elk antilichaam of kleurstof dat wordt gebruikt voor flowcytometrische analyse zorgvuldig te titreren; er zijn zeer weinig gegevens beschikbaar over hoe verschillende sputumverzamelingsmethoden de beoogde eiwitten voor flowcytometrie beïnvloeden.

Het tweede probleem dat het enthousiasme voor het gebruik van sputum voor diagnostiek, voornamelijk gerelateerd aan flowcytometrie, dempt, is het celnummer. Het probleem is het verzamelen van voldoende levensvatbare cellen voor een betrouwbare analyse. Twee studies toonden aan dat sputummonsters verzameld door niet-invasieve methoden, met behulp van een hulpmiddel, voldoende levensvatbare cellen bevatten die kunnen worden gebruikt in klinische diagnose- of ^{onderzoeksstudies16,24}. Geen van deze studies ging echter in op de kwestie van celaantallen met betrekking tot flowcytometrie.

Voor de studies die de basis vormen voor dit protocol, werden sputummonsters verzameld van deelnemers met een hoog risico op het ontwikkelen van longkanker volgens goedgekeurde institutionele richtlijnen voor elke onderzoekslocatie. Deelnemers met een hoog risico werden gedefinieerd als tussen 55-75 jaar, 30 pakjaren gerookt en niet gestopt met roken in de afgelopen 15 jaar. Patiënten kregen te zien hoe ze het acapella-apparaat moesten gebruiken volgens de instructies van de ^fabrikant29 en verzamelden sputum gedurende drie opeenvolgende dagen thuis. Het monster werd tot de laatste verzameling in de koelkast bewaard. Op de laatste ophaaldag werd het monster ‘s nachts met een bevroren coldpack naar het laboratorium verscheept. De monsters werden verwerkt tot een enkele celsuspensie op de dag dat ze werden ontvangen. Met deze methode van sputumverzameling worden meer dan voldoende levensvatbare cellen verkregen voor een betrouwbare flowcytometrische analyse.

Ten slotte, en gerelateerd aan de vorige kwestie van het celnummer, is de vraag hoe de sputumcellen uit zijn mucineuze omgeving kunnen worden bevrijd. Hoe kunnen de cellen levensvatbaar worden gehouden en een enkele celsuspensie creëren die de flowcytometer niet verstopt? Gebaseerd op het eerste werk van Pizzichini et ^al.30 en Miller et ^al.31, beschrijft dit protocol een eenvoudige en betrouwbare methode voor sputumverwerking tot een enkele celsuspensie die geschikt is voor flowcytometrische analyse. Deze methode heeft gevestigde richtlijnen in flowcytometrie32,33,34 gebruikt om een efficiënte antilichaametiketteringsstrategie te ontwikkelen om hematopoëtische en epitheelcellen in sputum te identificeren en instrumentinstellingen, kwaliteitscontrolemaatregelen en analyserichtlijnen te bieden die sputumanalyse standaardiseren op een flowcytometrisch platform.

Protocol

Alle stappen van de sputumverwerking worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. 1. Reagensvoorbereiding voordat met sputumdissociatie wordt begonnen Ontdooi 1% paraformaldehyde (PFA), 25 ml per monster op ijs en houd koud tot gebruik.LET OP: PFA is giftig bij inademing en huidcontact. Bereid het fixeermiddel volgens de instructies van de fabrikant en vries het tot gebruik in bij -20 °C in 25 ml aliquots. Benade…

Representative Results

Dit protocol is ontwikkeld met een klinische laboratoriumomgeving in het achterhoofd. De focus tijdens de ontwikkeling van het protocol lag op eenvoud, efficiëntie en reproduceerbaarheid. Het bleek dat de meest tijdrovende stap in de verwerking van sputum het tellen van de cellen was. Daarom is het protocol zo opgezet dat sputumverwerking en celetikettering onafhankelijk van het tellen van cellen kunnen worden uitgevoerd zonder tijdverlies. Een nauwkeurig celgetal, dat nog steeds nodig is om het monster op de juiste man…

Discussion

De cellulaire inhoud van sputum omvat een grote verscheidenheid aan brede cellen, vaak vergezeld van veel ^puin37. Bovendien vereist sputumanalyse een kwaliteitscontrole die bevestigt dat het monster wordt verzameld uit de long in plaats van de ^mondholte38. Daarom is het niet zo eenvoudig om sputum te analyseren door flowcytometrie als voor bijvoorbeeld bloed, dat een veel schonere en homogene celsuspensie vrijgeeft. Dit protocol heeft al deze problemen aangepakt: het bieden…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061