Kvalitetskontrollert sputumanalyse ved flowcytometri

Summary

Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon og den påfølgende karakteriseringen av cellulære delsett på standard flow cytometriske plattformer.

Abstract

Sputum, som er mye brukt til å studere cellulært innhold og andre mikromiljøfunksjoner for å forstå lungens helse, analyseres tradisjonelt ved hjelp av cytologibaserte metoder. Verktøyet er begrenset fordi lesing av lysbildene er tidkrevende og krever høyt spesialisert personell. Videre gjør omfattende rusk og tilstedeværelsen av for mange squamous epitelceller (SECs), eller kinnceller, ofte en prøve utilstrekkelig for diagnose. I motsetning gir strømningscytometri mulighet for høy gjennomstrømning fenotyping av cellulære populasjoner samtidig som rusk og SECer utelates.

Protokollen som presenteres her beskriver en effektiv metode for å dissosiere sputum i en enkelt celle suspensjon, antistoff flekk og fikse cellulære populasjoner, og skaffe prøver på en strømning cytometrisk plattform. En gating strategi som beskriver utelukkelse av rusk, døde celler (inkludert SECs) og celle dobler presenteres her. Videre forklarer dette arbeidet også hvordan man analyserer levedyktige, enkle sputumceller basert på en klynge av differensiering (CD) 45 positive og negative populasjoner for å karakterisere hematopoietiske og epiteliale avgrensningsundergrupper. Et kvalitetskontrolltiltak er også gitt ved å identifisere lungespesifikke makrofager som bevis på at en prøve er avledet fra lungen og ikke er spytt. Til slutt har det blitt demonstrert at denne metoden kan brukes på forskjellige cytometriske plattformer ved å gi sputumprofiler fra samme pasient analysert på tre strømningscytometere; Navios EX, LSR II og Lyric. Videre kan denne protokollen endres for å inkludere flere mobilmarkører av interesse. En metode for å analysere en hel sputumprøve på en strømningscytometrisk plattform presenteres her som gjør sputum egnet for å utvikle høygjennomstrømningsdiagnostikk av lungesykdom.

Introduction

Tekniske fremskritt innen maskinvare og programvare for flytcytometere har gjort det mulig å identifisere mange forskjellige cellepopulasjoner ^{samtidig1,2,3,4}. Utnyttelsen av strømningscytometeret i hematopoietisk celleforskning har for eksempel ført til en mye bedre forståelse av ^{immunsystemet2} og det cellulære hierarkiet i det hematopoietiske ^systemet5, samt det diagnostiske skillet mellom en rekke forskjellige blodkreft6,7,8. Selv om de fleste sputumceller er av hematopoietisk opprinnelse9,10,11, har strømningscytometri ikke blitt mye brukt på sputumanalyse for diagnostiske formål. Flere studier tyder imidlertid på at evalueringen av immuncellepopulasjoner i sputum (den viktigste undergruppen av celler) kan være til stor hjelp ved diagnostisering og/eller overvåking av sykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS)12,13,14,15. Videre tillater eksistensen av epitelspesifikke markører som kan brukes i strømningscytometri forhør av følgende mest signifikante undergruppe av celler i sputum, lungeepitelceller.

I tillegg til evnen til å analysere mange forskjellige cellepopulasjoner av forskjellig vevsopprinnelse, kan et strømningscytometer evaluere et stort antall celler på relativt kort tid. Til sammenligning krever lysbildebaserte, cytologiske typer analyser ofte høyt spesialisert personell og/eller utstyr. Disse analysene kan være arbeidskrevende, noe som fører til at bare en andel av sputumprøven ^analyseres16.

Tre kritiske spørsmål begrenser den utbredte bruken av sputum i strømningscytometri. Det første problemet gjelder innsamling av sputum. Sputum samles gjennom en huff hoste som utviser slim fra lungene inn i munnhulen, og spytter deretter inn i en oppsamlingskopp. Siden slimet beveger seg gjennom munnhulen, er det stor sjanse for SEC-forurensning. Denne forurensningen kompliserer prøveanalysen, men problemet rettes lett på en strømningscytometrisk plattform, som vist i denne studien.

Ikke alle kan produsere sputum spontant; Derfor er flere enheter utviklet for å hjelpe til med sputumsamlingen på en ikke-invasiv ^måte17. Forstøveren er en slik enhet og har vist seg å produsere pålitelige sputumprøver18,19,20. Selv om forstøveren er en svært effektiv måte å ikke invasivt samle sputum på, krever bruken fortsatt en innstilling på et medisinsk anlegg med spesialisert ^personell21. I motsetning til dette kan håndholdte enheter som lungefløyten22,23,24 og acapella16,25 brukes hjemme siden de er veldig brukervennlige. Disse hjelpeenhetene er både trygge og kostnadseffektive.

For oss ga acapella konsekvent bedre resultater enn lungefløyten16, og derfor er acapella-enheten valgt for sputumsamlinger. En 3-dagers samlingsprøve ble bestemt fordi hovedformålet med bruk av sputum er å utvikle en ^{lungekreftdeteksjonstest16}. Det har vist seg at en 3-dagers prøve øker sannsynligheten for lungekreftdeteksjon sammenlignet med en 1- eller 2-dagers prøve26,27,28. Imidlertid kan andre metoder for sputumsamling være å foretrekke for forskjellige formål. Hvis en annen sputumoppsamlingsmetode brukes enn den som er beskrevet her, anbefales det å nøye titrate hvert antistoff eller fargestoff som brukes til strømningscytometrisk analyse; svært lite data er tilgjengelig om hvordan ulike sputuminnsamlingsmetoder påvirker de målrettede proteinene for strømningscytometri.

Det andre problemet som demper entusiasmen for å bruke sputum for diagnostikk, hovedsakelig relatert til strømningscytometri, er cellenummer. Problemet er innsamling av tilstrekkelige levedyktige celler for en pålitelig analyse. To studier viste at sputumprøver samlet inn ved ikke-invasive metoder, ved hjelp av en hjelpeenhet, inneholder nok levedyktige celler som kan brukes i klinisk diagnose eller ^{forskningsstudier16,24}. Imidlertid tok ingen av disse studiene opp spørsmålet om celletall angående strømningscytometri.

For studiene som danner grunnlaget for denne protokollen, ble det samlet inn sputumprøver fra deltakere med høy risiko for å utvikle lungekreft etter godkjente institusjonelle retningslinjer for hvert studiested. Høyrisikodeltakere ble definert som mellom 55-75 år, etter å ha røkt 30 pakkeår og ikke sluttet å røyke i løpet av de siste 15 årene. Pasienter ble vist hvordan man bruker acapella-enheten i henhold til produsentens ^{instruksjoner29} og samlet sputum i tre påfølgende dager hjemme. Prøven ble oppbevart i kjøleskapet til siste oppsamling. På den siste innsamlingsdagen ble prøven sendt til laboratoriet over natten med en frossen kald pakke. Prøvene ble behandlet til en enkelt celle suspensjon den dagen de ble mottatt. Med denne metoden for sputumsamling oppnås mer enn nok levedyktige celler for en pålitelig strømningscytometrisk analyse.

Til slutt, og relatert til det forrige cellenummerproblemet, er spørsmålet om hvordan du frigjør sputumcellene fra det mucinøse miljøet. Hvordan kan cellene holdes levedyktige og skape en enkelt cellefjæring som ikke tetter strømningscytometeret? Basert på innledende arbeid av Pizzichini et ^al.30 og Miller et ^al.31, beskriver denne protokollen en enkel og pålitelig metode for sputumbehandling i en enkelt cellefjæring som er egnet for strømningscytometrisk analyse. Denne metoden har brukt veletablerte retningslinjer i flow cytometry32,33,34 for å utvikle en effektiv antistoffmerkingsstrategi for å identifisere hematopoietiske og epitelceller i sputum og gi instrumentinnstillinger, kvalitetskontrolltiltak og analyseretningslinjer som standardiserer sputumanalyse på en strømningscytometrisk plattform.

Protocol

Alle trinn i sputumbehandlingen utføres i et biologisk sikkerhetsskap med passende personlig verneutstyr. 1. Reagensforberedelse før du starter sputum dissosiasjon Tine 1% Paraformaldehyd (PFA), 25 ml per prøve på is, og hold deg kald til bruk.FORSIKTIG: PFA er giftig ved innånding og hudkontakt. Forbered fikseringsmiddelet i henhold til produsentens instruksjoner og frys ved -20 °C i 25 ml aliquots til bruk. Omtrent vekten av prøven og tine nok 0,1% Dithiothreit…

Representative Results

Denne protokollen ble utviklet med tanke på et klinisk laboratorium. Fokuset under utviklingen av protokollen var på enkelhet, effektivitet og reproduserbarhet. Det ble funnet at det mest tidkrevende trinnet i behandlingen av sputum telte cellene. Derfor er protokollen satt opp på en slik måte at sputumbehandling og cellemerking kan utføres uavhengig av celletelling uten tap av tid. Et nøyaktig celleantall, som fortsatt er nødvendig for å fortynne prøven på riktig måte for en uhindret løp, kan deretter oppnå…

Discussion

Det cellulære innholdet av sputum inkluderer et stort utvalg av brede celler, ofte ledsaget av mye ^rusk37. I tillegg krever sputumanalyse en kvalitetskontroll som bekrefter at prøven samles inn fra lungen i stedet for ^munnhulen38. Derfor er det ikke så enkelt å analysere sputum ved strømningscytometri som det er for blod, for eksempel, som frigjør en mye renere og homogen cellefjæring. Denne protokollen har adressert alle disse problemene: å gi instrumentinnstilling…

Materials

1% Paraformaldehyde Flow-Fix	Polysciences	25037
100 µM nylon cell strainers, Falcon #352360	Fisher Scientific	08-771-19
3 M NaOH	EMD	SX0593-1
50 mL conical falcon tube	Fisher Scientific	14-432-22
Alexa488 anti-human CD19	BioLegend	302219
Alexa488 anti-human CD3	BioLegend	300415
Alexa488 anti-human cytokeratin	BioLegend	628608
Alexa488 PanCK, CD3, and CD19 Isotype	BioLegend	400129
BV510 anti-human CD45	BioLegend	304036
CD66b FITC isotype	BD Biosciences	555748
CompBead Plus Compensation Beads	BD Biosciences	560497
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 250 mL	Fisher Scientific	09-761-4
Corning Polystyrene dispoable sterile bottle 500 mL	Fisher Scientific	09-761-10
CS&T beads	BD Biosciences	655051
DTT	Fisher Scientific	BP172-5
FITC anti-human CD66b	GeneTex	GTX75907
Fixable Viability Stain	BD Biosciences	564406
FlowCheck	Beckman Coulter	A69183
FlowSet	Beckman Coulter	A69184
HBSS	Fisher Scientific	14-175-095
NAC	Sigma-Aldrich	A9165
NIST Beads, 05 μM	Polysciences	64080
NIST Beads, 20 μM	Polysciences	64160
NIST Beads, 30 μM	Polysciences	64170
PE anti-human CD45	BioLegend	304039
PE-CF594 anti-human EpCAM	BD Biosciences	565399
PE-CF594 CD206/EpCAM Isotype	BD Biosciences	562292
PE-CR594 anti-human CD206	BD Biosciences	564063
Sodium citrate dihydrate	EMD	SX0445-1
Trypan Blue solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061