成像衍生的均方位移(iMSD)分析应用于大刺激小体,以突出它们在结构和动态特性方面的内在时间演化性质。然后将大孔蛋白酶体与胰岛素分泌颗粒(ISG)进行比较,作为具有时间不变平均结构/动态特性的亚细胞结构的参考。
成像衍生的均方位移(iMSD)用于解决亚细胞纳米结构的结构和动态特性,例如参与溶质和生物分子的内/胞外运输的囊泡。iMSD依赖于标准的延时成像,与任何光学设置兼容,并且不需要停留在单个物体上来提取轨迹。从每个iMSD迹线中,计算并组合平均结构和动态参数(即尺寸,局部扩散率,异常系数)的唯一三重态,以构建所研究的纳米结构的“iMSD特征”。
这种方法的有效性在这里用大孔蛋白酶体的示范案例证明了。这些囊泡随着时间的推移而进化,改变它们的平均大小,数量和动态特性,从细胞内运输的早期到晚期阶段。作为对照,胰岛素分泌颗粒(ISG)被用作生活在静止状态的亚细胞结构的参考,在这种状态下,整个物体群体的平均结构和动态特性在时间上是不变的。iMSD分析定量地突出了这些特殊特征,并为亚细胞水平的类似应用铺平了道路,无论是在生理还是病理状态下。
亚细胞纳米结构(例如,内吞/分泌囊泡,细胞器)在细胞信号传导调节1中起关键作用。正确调整其结构(例如,大小)和/或动态(例如,扩散率)特征决定了细胞如何响应内部或外部刺激2,3,4。基于这些证据,在许多病理条件下发现这些特征的改变也就不足为奇了。例子包括失调的内吞作用在癌症中的作用2,3,暴露于2型糖尿病的β细胞5中ISG水平上发现的结构和动态改变,球状细胞白细胞白细胞营养不良或半乳糖基神经酰胺脂质病6中溶酶体结构和转运特性的错误调节,以及神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)中内溶酶体通路的功能失调7。
在这种情况下,研究人员最近证明,通过适当调整空间和时间采样分辨率8,可以提高标准光学显微镜方法的性能。反过来,这可以进一步了解相关的生物过程。在实践中,这是通过时空波动分析算法实现的,该算法同时直接从标准光学显微镜图像堆栈中提取扩散物体的平均结构和动态特性,而无需对感兴趣的生物物体进行任何初步了解并提取单个物体轨迹。所有这些信息都包含在该方法的单个输出中:iMSD迹线9 (有关iMSD迹线派生和分析的详细信息在 补充文件1中给出)。
由此产生的实验方案由几个步骤组成。首先,以高时间分辨率对感兴趣区域进行成像。然后,从图像堆栈中计算平均时空相关函数。最后,通过高斯拟合一系列相关函数,直接从成像中得到平均“扩散定律”,并对其进行分析,以识别物体扩散模式。该方法的潜力已经被证明用于各种生物对象,从分子到纳米颗粒,甚至整个亚细胞器/结构9,10,11,12,13,14,15。
本文报告了iMSD在大蛋白酶体中的应用,以突出其平均(即在整个种群水平上)结构和动态特性的内在,不可逆的时间演化性质。此外,将这些内吞囊泡与ISG进行比较,作为处于“静止状态”的亚细胞结构的参考,即在整个颗粒群体的平均结构/动态特性在任何时间点保持恒定的状态。大毛细胞增多症定义了由质膜的广泛重组(或褶皱)引发的一系列事件,以形成外部大旋细胞结构,然后内化16。形成的早期巨噬细胞体与吞噬体非常相似。同时,它们可以与其他形式的内吞囊泡区分开来,因为它们具有特征性的大尺寸,形态异质性和缺乏蛋白质涂层结构。
生化测定显示,在内化后,巨蛋白酶体逐渐富集其他内吞途径的蛋白质标记物,反过来表明它们的身份在运输过程中不断变化17。使用针对内体途径已知标记物的抗体,证明大孔蛋白酶体逐渐采用经典的内体特征:它们减小,发展成晚期内吞结构(例如溶酶体),或者通过膜介导的特定分子标记物(例如,分选神经素)最终失去其身份18,19.总体情况是,细胞内的每个大蛋白酶体在从质膜运输到最终的细胞内命运的过程中都会不可逆地改变其结构和动态(以及分子)身份。因此,整个大孔蛋白酶体群体的结构/动力学/分子特性也沿着相同的时间路径发生变化。由于对整个被观察对象群体的平均特性具有内在敏感性,iMSD方法通过量化关键平均参数(即局部扩散率和异常系数(动态特性)以及大孔蛋白酶体(结构特性)在其细胞内运输的任何阶段的平均大小(结构特性)来定量地描述“进化性质”。
为了进行比较,在β细胞模型中对众所周知的细胞内膜封闭结构ISG进行了类似的测量。与巨噬细胞体一样,ISG结构和动态特性的调节,从它们在反式高尔基体网络(TGN)的产生到它们在质膜上的胞吐,对于ISG功能20的正确执行至关重要。然而,与巨蛋白酶体不同,ISG生活在“平稳状态”中,在任何时候,ISG寿命的所有功能/结构/分子阶段同时存在于细胞内,并且每个阶段都由特定的ISG亚群表示。这意味着,尽管每个颗粒都不可逆地从生物发生进化到分泌,但整个颗粒群体的平均结构/动态特性预计在任何时间点都保持不变(除非静止状态条件被改变,例如,通过葡萄糖,胆固醇和细胞因子等外部刺激13)。iMSD分析证实了这一点。
与可用于检索类似信息的技术相比,iMSD的特性和优势是显而易见的。对于结构信息,首选是透射电子显微镜(TEM)分析。通过这种方法,可以检索分子分辨率甚至更高的超微结构细节,即使对于亚细胞纳米结构也是如此。然而,TEM的特殊空间分辨率是以牺牲时间维度中的信息为代价实现的,这在这里很有趣。为了弥补这一点,活细胞成像技术的最新进展特别令人感兴趣。这些包括具有更高性能(例如亮度和光稳定性)的新型荧光标记物,优化的标记程序以及更灵敏的检测器。此外,分析工具可用于解决结构(例如,通过基于相量的局部图像相关光谱分析的“大小”,PLICS23,通过数和亮度分析24进行聚集/齐聚)和动态(例如,通过单粒子跟踪的扩散定律,即(SPT)25,26,27,28) 参数在亚细胞尺度上。SPT方法允许直接访问物体轨迹及其MSD。然而,缺点是需要低密度的探头和非常明亮的标签以及许多单一物体轨迹来测量以满足统计标准。关于测量的时间分辨率,无机的光稳定探针(例如,量子点或金属纳米颗粒)可以提高SPT性能,但以牺牲复杂的生产和标记程序为代价。
与这些标准相比,这里描述的iMSD方法显示出一些关键优势。首先,这种方法可以与相对暗淡的荧光标签结合使用,例如遗传编码的荧光蛋白(例如,应用于ISG)。因此,与SPT相比,由于所需的光子量较低,因此实现了更高的时间分辨率(使用相同的标签)。其次,iMSD方法仅受时间分辨率的限制,而不受衍射的限制。事实上,尽管使用了衍射极限光学设置,但即使低于衍射极限也可以测量平均分子位移,正如使用STICS29已经证明的分子流所示。位移测量的实际分辨率取决于测量相关函数的精度(就信噪比而言),从而解释了为什么它不受衍射的限制。因此,可以测量的最小位移显然取决于目标物体的扩散率和成像设置的时间分辨率。
在这方面,重要的是要考虑用激光扫描显微镜应用于亚细胞纳米结构,例如大孔蛋白酶体或胰岛素颗粒是最佳的:可用的扫描速度明显高于目标对象的动力学。在这种情况下,对象在采集过程中的运动可以忽略不计,相关函数可以近似于高斯函数。最后,iMSD方法可以很容易地应用于基于光栅扫描或基于宽视场相机成像的各种商业光学显微镜设置,无需系统校准(仅当需要实现颗粒尺寸的准确估计时才需要)。该方法工作的一个重要参数是适当的空间采样。作为一般规则,为了达到拟合算法的满意收敛,用于成像的感兴趣区域的最小尺寸应至少大于最大位移的3倍。
总之,iMSD方法只需要配备用于快速采集的显微镜。感兴趣的结构可以标记到任何遗传编码或有机荧光团,从而实现多通道成像。预计在不久的将来,交叉iMSD分析将用于选择亚细胞纳米结构的亚群,并揭示它们在细胞内的相互作用和共扩散,后者是细胞生物物理学的热门话题。如果iMSD分析丢失了任何细节,这肯定与动态亚细胞纳米结构中的大量分子信息有关。由于时间分辨率差,这些信息在测量过程中不可避免地被平均化。然而,从理论上讲,由于检索分子信息的可能性,不存在技术限制,前提是可以达到足够的采集速度8。由于检测器速度/灵敏度和成像技术的不断改进,预计有关整个亚细胞区室及其分子成分的信息将从单个数据集中提取。
The authors have nothing to disclose.
这项工作已获得欧洲研究理事会(ERC)根据欧盟地平线2020研究与创新计划(赠款协议无866127,项目CAPTUR3D)的资助。
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |