Imaging-derived mean square displacement (iMSD) analyse anvendes på makropinosomer for at fremhæve deres iboende tidsudviklende natur med hensyn til strukturelle og dynamiske egenskaber. Makropinosomer sammenlignes derefter med insulinsekretoriske granulater (ISG’er) som reference for subcellulære strukturer med tidsinvariante gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber.
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) bruges til at adressere de strukturelle og dynamiske egenskaber ved subcellulære nanostrukturer, såsom vesikler involveret i endo / exocytotisk handel med opløste stoffer og biomolekyler. iMSD er afhængig af standard time-lapse-billeddannelse, er kompatibel med enhver optisk opsætning og behøver ikke at dvæle ved enkelte objekter for at udtrække baner. Fra hvert iMSD-spor beregnes en unik triplet af gennemsnitlige strukturelle og dynamiske parametre (dvs. størrelse, lokal diffusivitet, uregelmæssig koefficient) og kombineres for at opbygge “iMSD-signaturen” af den nanostruktur, der undersøges.
Styrken af denne tilgang er bevist her med det eksemplariske tilfælde af makropinosomer. Disse vesikler udvikler sig i tide og ændrer deres gennemsnitlige størrelse, antal og dynamiske egenskaber, der går fra tidlige til sene stadier af intracellulær handel. Som en kontrol anvendes insulinsekretoriske granulater (ISG’er) som reference for subcellulære strukturer, der lever i stationær tilstand, hvor de gennemsnitlige strukturelle og dynamiske egenskaber for hele populationen af objekter er uforanderlige i tide. iMSD-analysen fremhæver disse ejendommelige træk kvantitativt og baner vejen for lignende anvendelser på subcellulært niveau, både i de fysiologiske og patologiske tilstande.
Subcellulære nanostrukturer (f.eks. endocytiske/sekretoriske vesikler, organeller) spiller en central rolle i cellesignaleringsregulering1. Korrekt indstilling af deres strukturelle (f.eks. Størrelse) og/eller dynamiske (f.eks. diffusivitet) egenskaber bestemmer, hvordan cellen reagerer på interne eller eksterne stimuli 2,3,4. Baseret på dette bevis er det ikke overraskende, at ændringer af disse egenskaber findes i mange patologiske tilstande. Eksempler omfatter den rolle, som misreguleret endocytose spiller i kræft 2,3, de strukturelle og dynamiske ændringer, der findes på niveauet af ISG’er i β-celler udsat for type 2-diabetesbetingelser5, misregulering af lysosomale strukturelle og transportegenskaber i globoid-celle leukodystrofi eller galactosylceramidlipidose6 og dysfunktionaliteter i den endo-lysosomale vej i neurodegenerative lidelser (f.eks. Alzheimers sygdom)7.
I denne sammenhæng har forskere for nylig bevist, at ydeevnen for standard optiske mikroskopimetoder kan forbedres ved korrekt indstilling af rumlig og tidsmæssig prøveudtagningsopløsning8. Dette kan igen give yderligere indsigt i biologiske processer af relevans. I praksis er dette muliggjort af en algoritme for spatiotemporal udsvingsanalyse, som samtidig ekstraherer de gennemsnitlige strukturelle og dynamiske egenskaber ved diffuserende objekter direkte fra standardstakken af optiske mikroskopibilleder uden behov for foreløbig viden om det biologiske objekt af interesse og ekstraktion af enkeltobjektbaner. Alle disse oplysninger er vedlagt i et enkelt output af metoden: et iMSD-spor9 (detaljer om iMSD-sporingsafledning og analyse findes i Supplerende fil 1).
Den resulterende eksperimentelle protokol består af et par trin. For det første udføres billeddannelse af interesseområdet ved høj tidsmæssig opløsning. Derefter beregnes gennemsnitlige rumlige-tidsmæssige korrelationsfunktioner ud fra stakken af billeder. Endelig opnås den gennemsnitlige ‘diffusionslov’ ved gaussisk tilpasning af serien af korrelationsfunktioner direkte fra billeddannelse og analyseres for at genkende objektdiffusionstilstanden. Metodens potentiale var allerede bevist for en række biologiske objekter, lige fra molekyler til nanopartikler og endda hele subcellulære organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.
Dette papir rapporterer iMSD-anvendelse på makropinosomer for at fremhæve deres iboende, irreversible tidsudviklende karakter med hensyn til deres gennemsnitlige (dvs. på hele befolkningsniveau) strukturelle og dynamiske egenskaber. Endvidere sammenlignes disse endocytiske vesikler med ISG’er som reference for subcellulære strukturer i en ‘stationær tilstand’, dvs. en tilstand, hvor de gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber for hele populationen af granulater forbliver konstante på ethvert tidspunkt. Makropinocytose definerer en række begivenheder initieret af den omfattende omorganisering (eller ruffling) af plasmamembranen for at danne en ekstern makropinocytisk struktur, der derefter internaliseres16. De dannede makropinosomer i det tidlige stadium ligner meget fagosomer. Samtidig kan de skelnes fra andre former for endocytiske vesikler på grund af deres karakteristiske store størrelse, morfologiske heterogenitet og mangel på protein-coat strukturer.
Biokemiske assays afslørede, at makropinosomer ved internalisering gradvist bliver beriget med proteinmarkører af andre endocytiske veje, hvilket igen tyder på, at deres identiteter løbende ændrer sig under menneskehandel17. Ved hjælp af antistoffer mod kendte markører for den endosomale vej blev det påvist, at makropinosomer gradvist vedtager klassiske endosomale træk: de formindskes i størrelse, udvikler sig til sene endocytiske strukturer (f.eks. Lysosomer) eller til sidst mister deres identitet via membranmedieret hentning af specifikke molekylære markører (f.eks. Sortering af nexiner)18,19 . Det overordnede scenario er, at hvert eneste makropinosom i cellen irreversibelt ændrer sin strukturelle og dynamiske (såvel som molekylære) identitet under handel fra plasmamembranen til dens endelige intracellulære skæbne. Som følge heraf ændres de strukturelle/dynamiske/molekylære egenskaber for hele populationen af makropinosomer også langs den samme tidsmæssige vej. Da iMSD-metoden er iboende følsom over for de gennemsnitlige egenskaber for hele populationen af observerede objekter, skildrer den kvantitativt den “udviklende natur” ved kvantificering af vigtige gennemsnitsparametre, dvs. den lokale diffusivitet og unormale koefficient (dynamiske egenskaber) og den gennemsnitlige størrelse af makropinosomerne (strukturelle egenskaber) på ethvert stadium af deres intracellulære handel.
Til sammenligning blev lignende målinger udført på en velkendt intracellulær membranlukket struktur, ISG, i en model af β-celler. Ligesom makropinosomer er reguleringen af ISG’ernes strukturelle og dynamiske egenskaber, fra deres genese ved Trans Golgi-netværket (TGN) til deres exocytose ved plasmamembranen, afgørende for korrekt udførelse af ISG-funktion20. I modsætning til makropinosomer lever ISG’er imidlertid i en ‘stationær tilstand’, hvor alle de funktionelle/strukturelle/molekylære stadier af ISG-levetiden til enhver tid er til stede samtidigt i cellen, og hver er repræsenteret af en specifik underpopulation af ISG’er. Det betyder, at selv om hvert enkelt granulat irreversibelt udvikler sig fra biogenese til sekretion, forventes de gennemsnitlige strukturelle/dynamiske egenskaber for hele granulpopulationen at forblive konstante på ethvert tidspunkt (medmindre de stationære tilstandsbetingelser ændres, for eksempel af eksterne stimuli såsom glukose, kolesterol og cytokiner13). Dette bekræftes af iMSD-analyse.
Egenskaberne og fordelene ved iMSD er tydelige sammenlignet med de tilgængelige teknikker til at hente analog information. For strukturel information er det foretrukne valg transmissionselektronmikroskopi (TEM) analyse. Ved denne metode kan ultrastrukturelle detaljer ved molekylær opløsning og endda ud over hentes, selv for subcellulære nanostrukturer. Ikke desto mindre opnås den ejendommelige rumlige opløsning af TEM på bekostning af oplysningerne i den tidsmæssige dimension, som er af interesse her. For at kompensere for dette er de seneste fremskridt inden for levende cellebilleddannelsesteknologier af særlig interesse. Disse omfatter nye fluorescerende markører med øget ydeevne (f.eks. Lysstyrke og fotostabilitet), optimerede mærkningsprocedurer og mere følsomme detektorer. Derudover er der analyseværktøjer til rådighed til at adressere både strukturelle (f.eks. ‘størrelse’ ved fasorbaseret analyse af lokal billedkorrelationsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering ved tal&lysstyrkeanalyse24) og dynamisk (f.eks. diffusionslov ved enkeltpartikelsporing, dvs. (SPT)25,26,27,28 ) parametre på den subcellulære skala. SPT-metoden giver direkte adgang til objektets bane og dets MSD. Ulempen er imidlertid behovet for en lav densitet af sonden og meget lyse etiketter og mange enkeltobjektbaner, der skal måles for at opfylde statistiske kriterier. Med hensyn til målingens tidsmæssige opløsning kan uorganiske, fotostable sonder (f.eks. kvanteprikker eller metalnanopartikler) øge SPT-ydeevnen, men på bekostning af komplekse produktions- og mærkningsprocedurer.
Sammenlignet med disse standarder viser iMSD-metoden, der er beskrevet her, nogle vigtige fordele. For det første kan denne tilgang anvendes sammen med relativt svage fluorescerende tags, såsom genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. Anvendelsen på ISG’er). Sammenlignet med SPT opnås således en højere tidsmæssig opløsning (ved hjælp af den samme etiket) på grund af den lavere mængde fotoner, der kræves8. For det andet er iMSD-metoden kun begrænset af den tidsmæssige opløsning, men ikke diffraktion. På trods af den anvendte diffraktionsbegrænsede optiske opsætning kan gennemsnitlige molekylære forskydninger selv under diffraktionsgrænsen måles, som allerede påvist for molekylære strømme ved anvendelse af STICS29. Den faktiske opløsning i målingen af forskydninger afhænger af, hvor præcist (med hensyn til signal til støj) korrelationsfunktionen kan måles, hvilket forklarer, hvorfor den ikke er begrænset af diffraktion. Det forekommer således klart, at den mindste forskydning, der kan måles, afhænger af diffusiviteten af objektet af interesse og den tidsmæssige opløsning af billeddannelsesopsætningen.
I den henseende er det vigtigt at overveje, at anvendelse på subcellulære nanostrukturer, såsom makropinosomer eller insulingranulater, med et laserscanningsmikroskop er optimal: den tilgængelige scanningshastighed er signifikant højere end dynamikken i objektet af interesse. I et sådant tilfælde er bevægelsen af objekterne under erhvervelsen ubetydelig, og korrelationsfunktionen kan tilnærmes af en gaussisk funktion. Endelig kan iMSD-tilgangen let anvendes på en lang række kommercielle optiske mikroskopiopsætninger baseret på rasterscanning eller vidvinkelkamerabaseret billeddannelse uden behov for systemkalibrering (kræves kun, hvis der skal opnås et nøjagtigt skøn over partikelstørrelsen). En vigtig parameter for, at metoden kan fungere, er korrekt rumlig prøveudtagning. For at opnå en tilfredsstillende konvergens mellem tilpasningsalgoritmen bør minimumsstørrelsen af det område, der er af interesse for billeddannelse, som hovedregel være mindst 3 gange større end den maksimale forskydning af interesse.
Afslutningsvis kræver iMSD-metoden kun et mikroskop udstyret til hurtig erhvervelse. Strukturen af interesse kan mærkes til enhver genetisk kodet eller organisk fluorofor, hvilket muliggør multikanals billeddannelse. Det forventes, at cross-iMSD-analyse vil blive brugt i den nærmeste fremtid til at vælge subpopulationer af subcellulære nanostrukturer og afsløre deres interaktioner og co-diffusion i cellen, hvor sidstnævnte er et varmt emne inden for cellulær biofysik. Hvis nogen detaljer går tabt ved iMSD-analyse, er dette bestemt relateret til den store mængde molekylær information inden for dynamiske subcellulære nanostrukturer. Sådanne oplysninger er uundgåeligt gennemsnitlige under målingen på grund af dårlig tidsmæssig opløsning. Teoretisk set er der imidlertid ingen teknisk grænse på grund af muligheden for at hente molekylær information, forudsat at der kan opnås tilstrækkelige anskaffelseshastigheder8. På grund af de løbende forbedringer i detektorhastighed / følsomhed og billeddannelsesteknologier forventes det, at information om hele det subcellulære rum og dets molekylære bestanddele vil blive ekstraheret fra et enkelt datasæt.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (EFR) under EU’s Forsknings- og Innovationsprogram Horisont 2020 (tilskudsaftale nr. 866127, projekt CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |