Imaging-avledet gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning (iMSD) analyse brukes på makropinosomer for å markere sin iboende tidsutvikling natur når det gjelder strukturelle og dynamiske egenskaper. Makropinosomer sammenlignes deretter med insulin sekretoriske granulater (ISG) som referanse for subcellulære strukturer med tidsinvariante gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskaper.
Imaging-avledede gjennomsnittlige firkantede forskyvninger (iMSD) brukes til å adressere strukturelle og dynamiske egenskaper til subcellulære nanostrukturer, for eksempel vesicles involvert i endo / eksocytotisk smugling av solutes og biomolekyler. iMSD er avhengig av standard tidsforløpavbildning, er kompatibel med ethvert optisk oppsett, og trenger ikke å dvele ved enkeltobjekter for å trekke ut baner. Fra hvert iMSD-spor beregnes og kombineres en unik trilling av gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske parametere (dvs. størrelse, lokal diffusitet, uregelmessig koeffisient) for å bygge “iMSD-signaturen” til nanostrukturen som studeres.
Styrken til denne tilnærmingen er bevist her med det eksemplariske tilfellet av makropinosomer. Disse vesiklene utvikler seg i tid, og endrer gjennomsnittlig størrelse, antall og dynamiske egenskaper som går fra tidlig til sen fase av intracellulær menneskehandel. Som en kontroll brukes insulinsekretoriske granulater (ISG) som referanse for subcellulære strukturer som lever i en stasjonær tilstand der de gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske egenskapene til hele populasjonen av objekter er konstante i tide. IMSD-analysen fremhever disse særegne egenskapene kvantitativt og baner vei for lignende applikasjoner på sub-cellulært nivå, både i fysiologiske og patologiske tilstander.
Subcellulære nanostrukturer (f.eks. endokytiske/sekretoriske vesikler, organeller) spiller en sentral rolle i cellesignalregulering1. Riktig justering av deres strukturelle (f.eks. størrelse) og/eller dynamiske (f.eks. diffusivitet) bestemmer hvordan cellen reagerer på interne eller eksterne stimuli 2,3,4. Basert på dette beviset er det ikke overraskende at endringer av disse egenskapene finnes i mange patologiske forhold. Eksempler omfatter rollen som feilregulert endokytose hos kreft 2,3, de strukturelle og dynamiske endringene som finnes på nivået av ISG i β-celler utsatt for Type-2 Diabetes forhold5, feilregulering av lysosomale strukturelle og transportegenskaper i globoid-celle leukodystrofi eller galaktosylceramid lipidose6, og dysfunksjonaliteter i endo-lysosomale banen i nevrodegenerative lidelser (f.eks.
I denne sammenhengen har forskere nylig bevist at ytelsen til standard optiske mikroskopimetoder kan forbedres ved å justere romlig og tidsmessig prøvetakingsoppløsning8 på riktig måte. Dette kan igjen gi ytterligere innsikt i biologiske prosesser av relevans. I praksis er dette muliggjort av en algoritme for romlig svingningsanalyse, som samtidig trekker ut de gjennomsnittlige strukturelle og dynamiske egenskapene til diffuserende objekter direkte fra standardstakken av optiske mikroskopibilder uten behov for foreløpig kunnskap om det biologiske objektet av interesse og utvinning av enkeltobjektbaner. All denne informasjonen er vedlagt i en enkelt utgang av metoden: en iMSD-spor9 (detaljer om iMSD-sporavledning og analyse er gitt i Supplemental File 1).
Den resulterende eksperimentelle protokollen består av noen få trinn. For det første utføres avbildning av interesseområdet med høy temporal oppløsning. Deretter beregnes gjennomsnittlige romlige-temporale korrelasjonsfunksjoner fra bildestakken. Til slutt, ved gaussisk tilpasning av serien av korrelasjonsfunksjoner, oppnås den gjennomsnittlige ‘diffusjonsloven’ direkte fra avbildning og analyseres for å gjenkjenne objektdiffusjonsmodus. Potensialet i metoden var allerede bevist for en rekke biologiske objekter, alt fra molekyler til nanopartikler og til og med hele subcellulære organeller / strukturer 9,10,11,12,13,14,15.
Dette dokumentet rapporterer iMSD-applikasjon til makropinosomer for å markere deres iboende, irreversible tidsutviklingsnatur når det gjelder deres gjennomsnittlige (dvs. på hele befolkningsnivå) strukturelle og dynamiske egenskaper. Videre sammenlignes disse endokytiske vesiklene med ISG-er som en referanse for subcellulære strukturer i en “stasjonær tilstand”, det vil si en tilstand der de gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskapene til hele populasjonen av granulater forblir konstante når som helst. Makropinocytose definerer en rekke hendelser initiert av den omfattende omorganiseringen (eller ruffling) av plasmamembranen for å danne en ekstern makropinocytisk struktur som deretter internaliseres16. De dannede tidlige makropinosomene ligner veldig på fagosomer. Samtidig kan de skille seg fra andre former for endokytiske vesicles på grunn av deres karakteristiske store størrelse, morfologisk heterogenitet og mangel på protein-frakkstrukturer.
Biokjemiske analyser avslørte at makropinosomer ved internalisering gradvis blir beriket med proteinmarkører fra andre endokytiske veier, noe som igjen tyder på at identiteten deres kontinuerlig endres under menneskehandel17. Ved hjelp av antistoffer mot kjente markører av endosomale banen ble det demonstrert at makropinosomer gradvis vedtar klassiske endosomale egenskaper: de avtar i størrelse, utvikler seg til sen endokytiske strukturer (f.eks. lysosomer), eller til slutt mister sin identitet via membranmediert gjenfinning av spesifikke molekylære markører (f.eks. sortering av nexiner)18,19 . Det overordnede scenariet er at hvert eneste makropinosom i cellen irreversibelt endrer sin strukturelle og dynamiske (så vel som molekylære) identitet under menneskehandel fra plasmamembranen til den endelige intracellulære skjebnen. Som et resultat endres også de strukturelle / dynamiske / molekylære egenskapene til hele befolkningen av makropinosomer langs samme temporale bane. Å være iboende følsom for gjennomsnittsegenskapene til hele befolkningen av observerte objekter, skildrer iMSD-metoden kvantitativt den ‘utviklende naturen’ ved kvantifisering av viktige gjennomsnittsparametere, det vil si den lokale diffusiviteten og uregelmessige koeffisienten (dynamiske egenskaper) og gjennomsnittsstørrelsen på makropinosomene (strukturell egenskap) i alle stadier av deres intracellulære menneskehandel.
Til sammenligning ble lignende målinger utført på en velkjent intracellulær membran-lukket struktur, ISG, i en modell av β-celler. Som makropinosomer er reguleringen av isgs strukturelle og dynamiske egenskaper, fra deres genesis ved Trans Golgi Network (TGN) til deres eksocytose ved plasmamembranen, avgjørende for riktig utførelse av ISG-funksjon20. Men i motsetning til makropinosomer lever ISG-er i en ‘stasjonær tilstand’ der alle funksjonelle / strukturelle / molekylære stadier av ISG-levetid samtidig er til stede i cellen, og hver er representert av en bestemt underbefolkning av ISG-er. Dette betyr at selv om hver eneste granulat utvikler seg irreversibelt fra biogenese til sekresjon, forventes de gjennomsnittlige strukturelle / dynamiske egenskapene til hele befolkningen av granulater å forbli konstant når som helst (med mindre de stasjonære tilstandsforholdene endres, for eksempel ved ytre stimuli som glukose, kolesterol og cytokiner13). Dette bekreftes av iMSD-analyse.
Egenskapene og fordelene ved iMSD er tydelige sammenlignet med teknikkene som er tilgjengelige for å hente analog informasjon. For strukturell informasjon er det foretrukne valget transmisjonselektronmikroskopianalyse (TEM). Ved denne metoden kan ultrastrukturelle detaljer ved molekylær oppløsning og til og med utover hentes, selv for subcellulære nanostrukturer. Likevel oppnås den særegne romlige oppløsningen av TEM på bekostning av informasjonen i den tidsmessige dimensjonen, som er av interesse her. For å kompensere for dette er de siste fremskrittene innen live-celle bildeteknologier av spesiell interesse. Disse inkluderer nye fluorescerende markører med økt ytelse (f.eks. lysstyrke og fotostabilitet), optimaliserte merkingsprosedyrer og mer følsomme detektorer. I tillegg er analytiske verktøy tilgjengelige for å adressere både strukturelle (f.eks. “størrelse” ved fasorbasert analyse av lokal bildekorrelasjonsspektroskopi, PLICS23, aggregering/oligomerisering etter tall-/lysstyrkeanalyse24) og dynamisk (f.eks. diffusjonslov ved enkeltpartikkelsporing, dvs. ) parametere på den subcellulære skalaen. SPT-metoden gir direkte tilgang til objektbanen og dens MSD. Ulempen er imidlertid behovet for en lav tetthet av sonden og svært lyse etiketter og mange enkeltobjektbaner som skal måles for å tilfredsstille statistiske kriterier. Med hensyn til den tidsmessige oppløsningen til målingen, kan uorganiske, fotostable sonder (f.eks. kvanteprikker eller metallnanopartikler) øke SPT-ytelsen, men på bekostning av komplekse produksjons- og merkingsprosedyrer.
Sammenlignet med disse standardene viser iMSD-metoden som er beskrevet her noen viktige fordeler. For det første kan denne tilnærmingen brukes sammen med relativt svake fluorescerende koder, for eksempel genetisk kodede fluorescerende proteiner (f.eks. applikasjonen til ISG). Således, sammenlignet med SPT, oppnås en høyere temporal oppløsning (ved hjelp av samme etikett) på grunn av den lavere mengden fotoner som kreves8. For det andre er iMSD-metoden begrenset bare av temporal oppløsning, men ikke diffraksjon. Faktisk, til tross for diffraksjonsbegrenset optisk oppsett som brukes, kan gjennomsnittlige molekylære forskyvninger selv under diffraksjonsgrensen måles, som allerede demonstrert for molekylære strømmer ved hjelp av STICS29. Den faktiske oppløsningen i måling av forskyvninger avhenger av hvor nøyaktig (når det gjelder signal til støy) korrelasjonsfunksjonen kan måles, og forklarer dermed hvorfor den ikke er begrenset av diffraksjon. Dermed ser det klart at minimumsforskyvningen som kan måles, avhenger av diffusiviteten til gjenstanden av interesse og den tidsmessige oppløsningen til bildeoppsettet.
I denne forbindelse er det viktig å vurdere at anvendelsen på subcellulære nanostrukturer, for eksempel makropinosomer eller insulingranulat, med et laserskanningsmikroskop er optimal: skannehastigheten som er tilgjengelig, er betydelig høyere enn dynamikken i objektet av interesse. I et slikt tilfelle er bevegelsen av objektene under oppkjøpet ubetydelig, og korrelasjonsfunksjonen kan tilnærmes av en gaussisk funksjon. Til slutt kan iMSD-tilnærmingen enkelt brukes på et bredt spekter av kommersielle optiske mikroskopioppsett basert på rasterskanning eller vidfeltkamerabasert bildebehandling, uten behov for systemkalibrering (kreves bare hvis et nøyaktig estimat av partikkelstørrelse må oppnås). En viktig parameter for at metoden skal fungere er riktig romlig prøvetaking. Som en generell regel, for å nå tilfredsstillende konvergens av tilpasningsalgoritmen, bør minimumsstørrelsen på interesseområdet for avbildning være minst 3 ganger større enn maksimal forskyvning av interesse.
Til slutt krever iMSD-metoden bare et mikroskop utstyrt for rask oppkjøp. Strukturen av interesse kan merkes til enhver genetisk kodet eller organisk fluorofor, og dermed muliggjør flerkanalsavbildning. Det er tenkt at kryss-iMSD-analyse vil bli brukt i nær fremtid for å velge subpopulasjoner av subcellulære nanostrukturer og avsløre deres interaksjoner og ko-diffusjon i cellen, sistnevnte er et hett tema i cellulær biofysikk. Hvis noen detaljer går tapt ved iMSD-analyse, er dette absolutt relatert til den store mengden molekylær informasjon innen dynamiske subcellulære nanostrukturer. Slik informasjon er uunngåelig gjennomsnittet ut under målingen på grunn av dårlig temporal oppløsning. Teoretisk sett er det imidlertid ingen teknisk grense på grunn av muligheten til å hente molekylær informasjon, forutsatt at tilstrekkelige anskaffelseshastigheter kan oppnås8. På grunn av de kontinuerlige forbedringene i detektorhastighet / følsomhet og bildeteknologi, er det tenkt at informasjon om hele undercellerommet og dets molekylære bestanddeler vil bli hentet fra et enkelt datasett.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horisont 2020 (tilskuddsavtale Nr. 866127, prosjekt CAPTUR3D).
100x Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378-016 | Cell medium supplement |
C-peptide-EGFP | Plasmid | ||
DMEM High Glucose | Gibco | 31053028 | Cell medium (HeLa) |
FBS | Gibco | 10082147 | Cell medium supplement |
Fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | Reagent |
HeLa | ATCC | CCL-61 | Cell Line |
Lipofectamine 2000 | TermoFisher | 11668019 | Trasfection reagent |
Lysotracker Red DND-99 | Gibco | L7528 | Reagent |
Matlab | MathWork | Software | |
Microscope-suitable cell dishes | Willco | GWSt-3522 | Petri dishes |
Olympus FV1000 | Olympus Japan | Confocal microscope | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835063 | Cell medium (INS-1E) |