الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي باستخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC)
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي. يمكن ل MMC زراعة الكائنات الحية الدقيقة وزراعتها بشكل تلقائي ومستمر ومراقبة نموها عبر الإنترنت بإنتاجية عالية نسبيا وتوازي جيد ، مما يقلل من استهلاك العمالة والكواشف.
Abstract
عادة ما يكون لطرق زراعة الميكروبات التقليدية عمليات مرهقة ، وإنتاجية منخفضة ، وكفاءة منخفضة ، واستهلاك كبير للعمالة والكواشف. وعلاوة على ذلك، فإن طرق الزراعة عالية الإنتاجية القائمة على الصفائح الدقيقة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة لها حالة نمو ميكروبية ضعيفة وتوازي تجريبي بسبب انخفاض الأكسجين المذاب، وضعف الخليط، والتبخر الشديد والتأثير الحراري. نظرا للعديد من مزايا القطرات الدقيقة ، مثل الحجم الصغير ، والإنتاجية العالية ، والقدرة القوية على التحكم ، يمكن لتقنية الموائع الدقيقة القائمة على القطرات التغلب على هذه المشكلات ، والتي تم استخدامها في العديد من أنواع الأبحاث حول زراعة الميكروبات عالية الإنتاجية وفحصها وتطورها. ومع ذلك ، لا تزال معظم الدراسات السابقة في مرحلة بناء المختبرات وتطبيقها. بعض القضايا الرئيسية ، مثل المتطلبات التشغيلية العالية ، وصعوبة البناء العالية ، ونقص تكنولوجيا التكامل الآلي ، تحد من التطبيق الواسع لتكنولوجيا الموائع الدقيقة بالقطرات في البحوث الميكروبية. هنا ، تم تطوير نظام آلي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقة للقطرات ، مما يحقق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والمراقبة عبر الإنترنت والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. في هذا البروتوكول ، تم أخذ الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 وسلالة E. coli الأساسية للميثانول (MeSV2.2) كأمثلة لتقديم كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية وعالية الإنتاجية نسبيا والتطور التكيفي بالتفصيل. هذه الطريقة سهلة التشغيل ، وتستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولها إنتاجية تجريبية عالية وتوازي جيد للبيانات ، والتي تتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وصديقة للعمليات وموثوقة النتائج للباحثين العلميين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.
Introduction
تعد الزراعة الميكروبية أساسا مهما للبحث العلمي الميكروبيولوجي والتطبيقات الصناعية ، والتي تستخدم على نطاق واسع في عزل وتحديد وإعادة بناء وفحص وتطور الكائنات الحية الدقيقة1،2،3. تستخدم طرق الزراعة الميكروبية التقليدية بشكل أساسي أنابيب الاختبار ، وقوارير الاهتزاز ، والألواح الصلبة كحاويات زراعة ، إلى جانب حاضنات الاهتزاز ، وأجهزة قياس الطيف الضوئي ، وقارئات الصفائح الدقيقة ، وغيرها من المعدات للزراعة الميكروبية والكشف عنها وفحصها. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لديها العديد من المشاكل ، مثل العمليات المرهقة ، والإنتاجية المنخفضة ، والكفاءة المنخفضة ، والاستهلاك الكبير للعمالة والكواشف. تعتمد طرق الزراعة عالية الإنتاجية التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة بشكل أساسي على الصفائح الدقيقة. لكن الصفيحة الدقيقة لديها مستوى منخفض من الأكسجين المذاب ، وخاصية خلط ضعيفة ، وتبخر شديد وتأثير حراري ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى ضعف حالة النمو وتجربة توازي الكائنات الحية الدقيقة4،5،6،7 ؛ من ناحية أخرى ، يجب أن تكون مجهزة بمعدات باهظة الثمن ، مثل محطات العمل التي تتعامل مع السوائل وأجهزة قراءة الصفائح الدقيقة ، لتحقيق الزراعة الآلية والكشف عن العملية 8,9.
كفرع مهم من تكنولوجيا الموائع الدقيقة ، تم تطوير الموائع الدقيقة بالقطيرات في السنوات الأخيرة بناء على أنظمة الموائع الدقيقة التقليدية ذات التدفق المستمر. إنها تقنية ميكروفلويديك منفصلة التدفق تستخدم مرحلتين سائلتين غير قابلتين للامتزاج (عادة ما يكون الزيت والماء) لتوليد قطرات صغيرة مشتتة والعمل عليها10. نظرا لأن القطرات الدقيقة لها خصائص الحجم الصغير ، ومساحة السطح المحددة الكبيرة ، وارتفاع معدل نقل الكتلة الداخلية ، وعدم وجود تلوث متقاطع ناتج عن التقسيم ، ومزايا التحكم القوي والإنتاجية العالية للقطرات ، فقد كانت هناك أنواع كثيرة من الأبحاث التي تطبق تقنية الموائع الدقيقة للقطرات في زراعة الكائنات الحية الدقيقة وفحصها وتطورهاعالية الإنتاجية 11 . ومع ذلك ، لا تزال هناك سلسلة من القضايا الرئيسية لجعل تكنولوجيا الموائع الدقيقة القطيرات شائعة وتطبق على نطاق واسع. أولا ، يعد تشغيل الموائع الدقيقة بالرذاذ مرهقا ومعقدا ، مما يؤدي إلى متطلبات تقنية عالية للمشغلين. ثانيا ، تجمع تقنية الموائع الدقيقة بالقطرات بين المكونات البصرية والميكانيكية والكهربائية ويجب أن ترتبط بسيناريوهات تطبيق التكنولوجيا الحيوية. من الصعب على مختبر واحد أو فريق واحد بناء أنظمة فعالة للتحكم في الموائع الدقيقة بالقطرات إذا لم يكن هناك تعاون متعدد التخصصات. ثالثا ، نظرا لصغر حجم القطرات الدقيقة (من بيكوليتر (pL) إلى ميكرولتر (μL)) ، يتطلب الأمر صعوبة كبيرة لتحقيق التحكم الآلي الدقيق والكشف الفوري عبر الإنترنت عن القطرات لبعض العمليات الميكروبية الأساسية مثل الزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات ، ومن الصعب أيضا بناء نظام معدات متكامل12.
من أجل معالجة المشاكل المذكورة أعلاه ، تم تطوير نظام تلقائي لزراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) بنجاح استنادا إلى تقنية الموائع الدقيقةللقطرات 13. يتكون MMC من أربع وحدات وظيفية: وحدة التعرف على القطرات ، ووحدة الكشف عن طيف القطرات ، ووحدة رقاقة الموائع الدقيقة ، ووحدة أخذ العينات. من خلال تكامل النظام والتحكم في جميع الوحدات ، يتم إنشاء نظام التشغيل الآلي بما في ذلك التوليد والزراعة والقياس (الكثافة البصرية (OD) والتألق) ، والانقسام ، والانصهار ، وفرز القطرات بدقة ، وتحقيق تكامل وظائف مثل التلقيح والزراعة والرصد والزراعة الفرعية والفرز وأخذ العينات التي تتطلبها عملية زراعة القطرات الميكروبية. يمكن أن تستوعب MMC ما يصل إلى 200 وحدة زراعة قطرات مكررة بحجم 2-3 ميكرولتر ، وهو ما يعادل 200 وحدة زراعة قارورة اهتزاز. يمكن لنظام زراعة القطرات الدقيقة تلبية متطلبات عدم التلوث والأكسجين المذاب والخلط وتبادل الطاقة الكتلية أثناء نمو الكائنات الحية الدقيقة ، وتلبية الاحتياجات المختلفة للبحوث الميكروبية من خلال وظائف متكاملة متعددة ، على سبيل المثال ، قياس منحنى النمو ، والتطور التكيفي ، والتحليل متعدد المستويات أحادي العامل ، وأبحاث وتحليل الأيض (استنادا إلى الكشف عن التألق)13،14.
هنا ، يقدم البروتوكول كيفية استخدام MMC لإجراء الزراعة الآلية والميكروبية والتطور التكيفي بالتفصيل (الشكل 1). أخذنا الإشريكية القولونية من النوع البري (E. coli) MG1655 كمثال لإثبات قياس منحنى النمو وسلالة E. coli الأساسية للميثانول MeSV2.215 لإثبات التطور التكيفي في MMC. تم تطوير برنامج تشغيل ل MMC ، مما يجعل العملية بسيطة وواضحة للغاية. في العملية برمتها ، يحتاج المستخدم إلى إعداد محلول البكتيريا الأولي ، وتعيين شروط MMC ، ثم حقن محلول البكتيريا والكواشف ذات الصلة في MMC. في وقت لاحق ، ستقوم MMC تلقائيا بتنفيذ عمليات مثل توليد القطرات ، والتعرف عليها وترقيمها ، والزراعة ، والتطور التكيفي. كما سيقوم بإجراء الكشف عبر الإنترنت (OD والتألق) للقطرات بدقة زمنية عالية وعرض البيانات ذات الصلة (التي يمكن تصديرها) في البرنامج. يمكن للمشغل إيقاف عملية الزراعة في أي وقت وفقا للنتائج واستخراج القطرات المستهدفة للتجارب اللاحقة. إن MMC سهل التشغيل ، ويستهلك كمية أقل من العمالة والكواشف ، ولديه إنتاجية تجريبية عالية نسبيا وتوازي جيد للبيانات ، مما يتمتع بمزايا كبيرة مقارنة بطرق الزراعة التقليدية. ويوفر منصة تجريبية منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل وقوية للباحثين لإجراء البحوث الميكروبية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم هذا البروتوكول كيفية استخدام نظام زراعة القطرات الدقيقة الميكروبية (MMC) لإجراء الزراعة الميكروبية الآلية والتطور التكيفي طويل الأجل. MMC هو نظام زراعة ميكروبية مصغر وآلي وعالي الإنتاجية. بالمقارنة مع طرق وأدوات الزراعة الميكروبية التقليدية عالية الإنتاجية ، تتمتع MMC بالعديد من المزا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0901500) ، والمشروع الوطني الرئيسي للأدوات والمعدات العلمية التابعة للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21627812) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20161080108). كما نشكر البروفيسورة جوليا أ. فورهولت (معهد علم الأحياء الدقيقة، قسم علم الأحياء، ETH زيورخ، زيوريخ 8093، سويسرا) على توفير النسخة 2.2 من سلالة الإشريكية القولونية الأساسية من الميثانول (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Referências
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
