Automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution ved hjælp af mikrobielt mikrodrøblekultursystem (MMC)
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution. MMC kan dyrke og underdyrke mikroorganismer automatisk og kontinuerligt og overvåge deres vækst online med relativt høj gennemstrømning og god parallelisering, hvilket reducerer arbejdskraft- og reagensforbruget.
Abstract
Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder har normalt besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. Desuden har mikropladebaserede dyrkningsmetoder med høj gennemstrømning, der er udviklet i de senere år, dårlig mikrobiel vækststatus og eksperimentparallalisering på grund af deres lave opløste ilt, dårlige blanding og alvorlige fordampning og termiske virkning. På grund af mange fordele ved mikrodråber, såsom lille volumen, høj gennemstrømning og stærk styrbarhed, kan den dråbebaserede mikrofluidiske teknologi overvinde disse problemer, som er blevet brugt i mange former for forskning i mikrobiel dyrkning, screening og evolution med høj gennemstrømning. De fleste tidligere undersøgelser forbliver dog på laboratoriets konstruktion og anvendelse. Nogle centrale spørgsmål, såsom høje driftskrav, høje konstruktionsvanskeligheder og mangel på automatiseret integrationsteknologi, begrænser den brede anvendelse af dråbemikrofluidisk teknologi i mikrobiel forskning. Her blev et automatiseret mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) med succes udviklet baseret på dråbemikrofluidisk teknologi, der opnåede integration af funktioner som podning, dyrkning, online overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves af processen med mikrobiel dråbedyrkning. I denne protokol blev vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 og en methanol-essentiel E. coli-stamme (MeSV2.2) taget som eksempler for at introducere, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og relativt høj gennemstrømning mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer. Denne metode er nem at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har store fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og resultatpåståelig eksperimentel platform for videnskabelige forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.
Introduction
Mikrobiel dyrkning er et vigtigt fundament for mikrobiologisk videnskabelig forskning og industrielle anvendelser, som i vid udstrækning anvendes til isolering, identifikation, rekonstruktion, screening og udvikling af mikroorganismer 1,2,3. Konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder bruger hovedsageligt reagensglas, rystekolber og faste plader som dyrkningsbeholdere kombineret med rystende inkubatorer, spektrofotometre, mikropladelæsere og andet udstyr til mikrobiel dyrkning, detektion og screening. Disse metoder har imidlertid mange problemer, såsom besværlige operationer, lav gennemstrømning, lav effektivitet og stort forbrug af arbejdskraft og reagenser. De dyrkningsmetoder med høj kapacitet, der er udviklet i de senere år, er hovedsageligt baseret på mikropladen. Men mikropladen har et lavt niveau af opløst ilt, dårlig blandingsegenskab og alvorlig fordampning og termisk effekt, hvilket ofte fører til dårlig vækststatus og eksperimentparallalisering af mikroorganismer 4,5,6,7; på den anden side skal den udstyres med dyrt udstyr, såsom væskehåndteringsarbejdsstationer og mikropladelæsere, for at opnå automatiseret dyrkning og procesdetektion 8,9.
Som en vigtig gren af mikrofluidisk teknologi er dråbemikrofluidik blevet udviklet i de senere år baseret på traditionelle kontinuerlige flow mikrofluidiske systemer. Det er en diskret flowmikrofluidisk teknologi, der bruger to utilgængelige væskefaser (normalt olie-vand) til at generere dispergerede mikrodråber og fungere på dem10. Fordi mikrodråber har karakteristika som lille volumen, stort specifikt overfladeareal, høj intern masseoverførselshastighed og ingen krydskontaminering forårsaget af opdeling og fordelene ved stærk styrbarhed og høj gennemstrømning af dråber, har der været mange former for forskning, der anvender dråbemikrofluidisk teknologi i dyrkning, screening og udvikling af mikroorganismer med høj gennemstrømning11 . Der er dog stadig en række nøgleproblemer for at gøre dråbemikrofluidisk teknologi populariseret og bredt anvendt. For det første er driften af dråbemikrofluidik besværlig og indviklet, hvilket resulterer i høje tekniske krav til operatørerne. For det andet kombinerer dråbemikrofluidisk teknologi optiske, mekaniske og elektriske komponenter og skal forbindes med bioteknologiske applikationsscenarier. Det er vanskeligt for et enkelt laboratorium eller team at bygge effektive dråbemikrofluidiske kontrolsystemer, hvis der ikke er noget tværfagligt samarbejde. For det tredje kræver det på grund af den lille mængde mikrodråbe (fra picoliter (pL) til mikroliter (μL)) meget vanskelighed at realisere den præcise automatiserede kontrol og onlinedetektion i realtid af dråber til nogle grundlæggende mikrobielle operationer såsom underdyrkning, sortering og prøveudtagning, og det er også vanskeligt at konstruere et integreret udstyrssystem12.
For at løse ovenstående problemer blev der med succes udviklet et automatisk mikrobielt mikrodråbekultursystem (MMC) baseret på dråbemikrofluidisk teknologi13. MMC består af fire funktionelle moduler: et dråbegenkendelsesmodul, et dråbespektrumdetektionsmodul, et mikrofluidisk chipmodul og et prøveudtagningsmodul. Gennem systemintegration og kontrol af alle moduler etableres automatiseret driftssystem, herunder produktion, dyrkning, måling (optisk densitet (OD) og fluorescens), opdeling, fusion, sortering af dråber nøjagtigt, idet der opnås integration af funktioner såsom podning, dyrkning, overvågning, underdyrkning, sortering og prøveudtagning, der kræves ved processen med mikrobiel dråbedyrkning. MMC kan rumme op til 200 replikate dråbedyrkningsenheder på 2-3 μL volumen, hvilket svarer til 200 dyrkningsenheder for rystekolber. Mikrodråbedyrkningssystemet kan opfylde kravene til ikke-kontaminering, opløst ilt, blanding og masseenergiudveksling under vækst af mikroorganismer og opfylde de forskellige behov for mikrobiel forskning gennem flere integrerede funktioner, f.eks. vækstkurvemåling, adaptiv evolution, enkeltfaktoranalyse på flere niveauer og metabolitforskning og -analyse (baseret på fluorescensdetektion)13,14.
Her introducerer protokollen, hvordan man bruger MMC til at udføre automatiseret og mikrobiel dyrkning og adaptiv evolution i detaljer (figur 1). Vi tog vildtype Escherichia coli (E. coli) MG1655 som et eksempel for at demonstrere vækstkurvemålingen og en methanol-essentiel E. coli-stamme MeSV2.215 for at demonstrere den adaptive udvikling i MMC. Der blev udviklet en driftssoftware til MMC, hvilket gør operationen meget enkel og klar. I hele processen skal brugeren forberede den oprindelige bakterieopløsning, indstille MMC-betingelserne og derefter injicere bakterieopløsningen og relaterede reagenser i MMC’ tilstand. Derefter udfører MMC automatisk operationer såsom dråbegenerering, genkendelse og nummerering, dyrkning og adaptiv evolution. Det udfører også online detektion (OD og fluorescens) af dråberne med høj tidsopløsning og viser de relaterede data (som kan eksporteres) i softwaren. Operatøren kan til enhver tid stoppe dyrkningsprocessen i henhold til resultaterne og udtrække måldråberne til efterfølgende forsøg. MMC er let at betjene, bruger mindre arbejdskraft og reagenser og har relativt høj eksperimentel gennemstrømning og god dataparallensitet, hvilket har betydelige fordele sammenlignet med konventionelle dyrkningsmetoder. Det giver en billig, driftsvenlig og robust eksperimentel platform for forskere til at udføre relateret mikrobiel forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol præsenterer, hvordan man bruger det mikrobielle mikrodropletkultursystem (MMC) til at udføre automatiseret mikrobiel dyrkning og langsigtet adaptiv evolution. MMC er et miniaturiseret, automatiseret og mikrobielt dyrkningssystem med høj gennemstrømning. Sammenlignet med konventionelle mikrobielle dyrkningsmetoder og instrumenter med høj gennemstrømning har MMC mange fordele såsom lavt arbejds- og reagensforbrug, enkel betjening, online detektion (OD og fluorescens), dataindsamling med høj tidsoplø…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project fra National Natural Science Foundation of China (21627812) og Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi takker også professor Julia A. Vorholt (Institut for Mikrobiologi, Biologisk Institut, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) for leveringen af den methanol-essentielle E. coli-stamme version 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Referências
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
