Culture microbienne automatisée et évolution adaptative à l’aide d’un système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC)
Summary
Ce protocole décrit comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative. MMC peut cultiver et sous-cultiver des micro-organismes automatiquement et en continu et surveiller en ligne leur croissance avec un débit relativement élevé et une bonne parallélisation, réduisant ainsi la consommation de main-d’œuvre et de réactifs.
Abstract
Les méthodes de culture microbienne conventionnelles ont généralement des opérations lourdes, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. De plus, les méthodes de culture à haut débit à base de microplaques développées ces dernières années ont un faible statut de croissance microbienne et une parallélisation expérimentale en raison de leur faible teneur en oxygène dissous, de leur mauvais mélange et de leur effet d’évaporation et thermique sévères. En raison de nombreux avantages des micro-gouttelettes, tels qu’un petit volume, un débit élevé et une forte contrôlabilité, la technologie microfluidique à base de gouttelettes peut surmonter ces problèmes, qui a été utilisée dans de nombreux types de recherche sur la culture, le criblage et l’évolution microbiens à haut débit. Cependant, la plupart des études antérieures restent au stade de la construction et de l’application du laboratoire. Certains problèmes clés, tels que les exigences opérationnelles élevées, la difficulté de construction élevée et l’absence de technologie d’intégration automatisée, limitent l’application généralisée de la technologie microfluidique des gouttelettes dans la recherche microbienne. Ici, un système automatisé de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes, permettant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance en ligne, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. Dans ce protocole, Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage et une souche d’E. coli essentielle au méthanol (MeSV2.2) ont été prises comme exemples pour présenter comment utiliser le MMC pour effectuer une culture microbienne automatisée et à débit relativement élevé et une évolution adaptative en détail. Cette méthode est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente de grands avantages par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et fiable en termes de résultats pour permettre aux chercheurs scientifiques de mener des recherches microbiennes connexes.
Introduction
La culture microbienne est une base importante pour la recherche scientifique microbiologique et les applications industrielles, qui est largement utilisée dans l’isolement, l’identification, la reconstruction, le criblage et l’évolution des micro-organismes 1,2,3. Les méthodes de culture microbienne conventionnelles utilisent principalement des tubes à essai, des flacons à agiter et des plaques solides comme récipients de culture, combinés à des incubateurs à secouer, des spectrophotomètres, des lecteurs de microplaques et d’autres équipements pour la culture, la détection et le dépistage microbiens. Cependant, ces méthodes présentent de nombreux problèmes, tels que des opérations fastidieuses, un faible débit, une faible efficacité et une grande consommation de main-d’œuvre et de réactifs. Les méthodes de culture à haut débit développées ces dernières années sont principalement basées sur la microplaque. Mais la microplaque a un faible niveau d’oxygène dissous, une mauvaise propriété de mélange et une évaporation et un effet thermique sévères, ce qui conduit souvent à un mauvais état de croissance et à une parallélisation expérimentale des micro-organismes 4,5,6,7; d’autre part, il doit être équipé d’équipements coûteux, tels que des postes de travail de manipulation de liquides et des lecteurs de microplaques, pour réaliser une culture automatisée et une détection de processus 8,9.
En tant que branche importante de la technologie microfluidique, la microfluidique des gouttelettes a été développée ces dernières années sur la base de systèmes microfluidiques traditionnels à flux continu. Il s’agit d’une technologie microfluidique à écoulement discret qui utilise deux phases liquides non miscibles (généralement huile-eau) pour générer des micro-gouttelettes dispersées et opérer sur elles10. Étant donné que les micro-gouttelettes présentent les caractéristiques d’un petit volume, d’une grande surface spécifique, d’un taux de transfert de masse interne élevé et d’aucune contamination croisée causée par la compartimentation, ainsi que les avantages d’une forte contrôlabilité et d’un débit élevé de gouttelettes, il existe de nombreux types de recherche appliquant la technologie microfluidique des gouttelettes dans la culture, le criblage et l’évolution à haut débit des micro-organismes11 . Cependant, il reste encore une série de questions clés pour rendre la technologie microfluidique des gouttelettes popularisée et largement appliquée. Tout d’abord, le fonctionnement de la microfluidique des gouttelettes est lourd et complexe, ce qui entraîne des exigences techniques élevées pour les opérateurs. Deuxièmement, la technologie microfluidique des gouttelettes combine des composants optiques, mécaniques et électriques et doit être associée à des scénarios d’application de la biotechnologie. Il est difficile pour un seul laboratoire ou une seule équipe de construire des systèmes efficaces de contrôle microfluidique des gouttelettes s’il n’y a pas de collaboration multidisciplinaire. Troisièmement, en raison du faible volume de micro-gouttelettes (du picoliter (pL) au microlitre (μL)), il faut beaucoup de difficulté pour réaliser le contrôle automatisé précis et la détection en ligne en temps réel des gouttelettes pour certaines opérations microbiennes de base telles que la sous-culture, le tri et l’échantillonnage, et il est également difficile de construire un système d’équipement intégré12.
Afin de résoudre les problèmes ci-dessus, un système automatique de culture microbienne de microgouttelettes (MMC) a été développé avec succès sur la base de la technologie microfluidique des gouttelettes13. La MMC se compose de quatre modules fonctionnels : un module de reconnaissance de gouttelettes, un module de détection de spectre de gouttelettes, un module de puce microfluidique et un module d’échantillonnage. Grâce à l’intégration du système et au contrôle de tous les modules, le système d’exploitation automatisé comprenant la génération, la culture, la mesure (densité optique (OD) et fluorescence), le fractionnement, la fusion, le tri des gouttelettes est établi avec précision, réalisant l’intégration de fonctions telles que l’inoculation, la culture, la surveillance, la sous-culture, le tri et l’échantillonnage requis par le processus de culture de gouttelettes microbiennes. MMC peut contenir jusqu’à 200 unités de culture de gouttelettes répliquées de 2 à 3 μL de volume, ce qui équivaut à 200 unités de culture de flacons agités. Le système de culture de micro-gouttelettes peut satisfaire aux exigences de non-contamination, d’oxygène dissous, de mélange et d’échange masse-énergie pendant la croissance des micro-organismes, et répondre aux divers besoins de la recherche microbienne grâce à de multiples fonctions intégrées, par exemple, la mesure de la courbe de croissance, l’évolution adaptative, l’analyse multi-niveaux à facteur unique et la recherche et l’analyse des métabolites (basées sur la détection de fluorescence)13,14.
Ici, le protocole présente en détail comment utiliser la MMC pour effectuer une culture automatisée et microbienne et une évolution adaptative (Figure 1). Nous avons pris comme exemple Escherichia coli (E. coli) MG1655 de type sauvage pour démontrer la mesure de la courbe de croissance et une souche d’E. coli essentielle au méthanol MeSV2.215 pour démontrer l’évolution adaptative de la MMC. Un logiciel d’exploitation pour MMC a été développé, ce qui rend l’opération très simple et claire. Dans l’ensemble du processus, l’utilisateur doit préparer la solution bactérienne initiale, définir les conditions de la MMC, puis injecter la solution bactérienne et les réactifs connexes dans la MMC. Par la suite, la MMC effectuera automatiquement des opérations telles que la génération de gouttelettes, la reconnaissance et la numérotation, la culture et l’évolution adaptative. Il effectuera également la détection en ligne (OD et fluorescence) des gouttelettes avec une résolution temporelle élevée et affichera les données associées (qui peuvent être exportées) dans le logiciel. L’opérateur peut arrêter le processus de culture à tout moment en fonction des résultats et extraire les gouttelettes cibles pour des expériences ultérieures. Le MMC est facile à utiliser, consomme moins de main-d’œuvre et de réactifs, et a un débit expérimental relativement élevé et une bonne parallélisation des données, ce qui présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes de culture conventionnelles. Il fournit une plate-forme expérimentale peu coûteuse, conviviale et robuste permettant aux chercheurs de mener des recherches microbiennes connexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole montre comment utiliser le système de culture de microgouttelettes microbiennes (MMC) pour effectuer une culture microbienne automatisée et une évolution adaptative à long terme. MMC est un système de culture microbienne miniaturisé, automatisé et à haut débit. Par rapport aux méthodes et instruments de culture microbiens à haut débit conventionnels, la MMC présente de nombreux avantages tels qu’une faible consommation de main-d’œuvre et de réactifs, un fonctionnement simple, une détectio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), le National Key Scientific Instrument and Equipment Project de la National Natural Science Foundation of China (21627812) et le Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Nous remercions également le professeur Julia A. Vorholt (Institut de microbiologie, Département de biologie, ETH Zurich, Zurich 8093, Suisse) pour la fourniture de la souche d’E. coli essentielle au méthanol version 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Referências
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