Automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution med hjälp av mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC)
Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att genomföra automatiserad mikrobiell odling och adaptiv evolution. MMC kan odla och subkultivera mikroorganismer automatiskt och kontinuerligt och övervaka online deras tillväxt med relativt hög genomströmning och god parallellisering, vilket minskar arbetskrafts- och reagensförbrukningen.
Abstract
Konventionella mikrobiella odlingsmetoder har vanligtvis besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagens. Dessutom har mikroplattbaserade odlingsmetoder med hög genomströmning som utvecklats under de senaste åren dålig mikrobiell tillväxtstatus och experimentparallellisering på grund av deras låga upplösta syre, dåliga blandning och allvarliga avdunstning och termiska effekt. På grund av många fördelar med mikrodroppar, såsom liten volym, hög genomströmning och stark kontrollerbarhet, kan den droppbaserade mikrofluidiska tekniken övervinna dessa problem, som har använts i många typer av forskning om mikrobiell odling, screening och evolution med hög genomströmning. De flesta tidigare studier förblir dock på scenen för laboratoriekonstruktion och tillämpning. Några viktiga frågor, såsom höga operativa krav, höga konstruktionssvårigheter och brist på automatiserad integrationsteknik, begränsar den breda tillämpningen av droppmikrofluidisk teknik i mikrobiell forskning. Här utvecklades ett automatiserat mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik, vilket uppnådde integration av funktioner som ympning, odling, onlineövervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. I detta protokoll togs vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 och en metanol-essentiell E. coli-stam (MeSV2.2) som exempel för att introducera hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och relativt högkapacitets mikrobiell odling och adaptiv utveckling i detalj. Denna metod är lätt att använda, förbrukar mindre arbetskraft och reagens och har hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har stora fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och resultatsäker experimentell plattform för vetenskapliga forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.
Introduction
Mikrobiell odling är en viktig grund för mikrobiologisk vetenskaplig forskning och industriella tillämpningar, som används i stor utsträckning vid isolering, identifiering, rekonstruktion, screening och utveckling av mikroorganismer 1,2,3. Konventionella mikrobiella odlingsmetoder använder huvudsakligen provrör, skakkolvar och fasta plattor som odlingsbehållare, i kombination med skakinkubatorer, spektrofotometrar, mikroplattläsare och annan utrustning för mikrobiell odling, detektion och screening. Dessa metoder har emellertid många problem, såsom besvärliga operationer, låg genomströmning, låg effektivitet och stor konsumtion av arbetskraft och reagenser. De odlingsmetoder med hög kapacitet som utvecklats under de senaste åren är huvudsakligen baserade på mikroplattan. Men mikroplattan har en låg nivå av upplöst syre, dålig blandningsegenskap och svår avdunstning och termisk effekt, vilket ofta leder till dålig tillväxtstatus och experimentparallellisering av mikroorganismer 4,5,6,7; å andra sidan måste den vara utrustad med dyr utrustning, såsom vätskehanteringsarbetsstationer och mikroplattläsare, för att uppnå automatiserad odling och processdetektering 8,9.
Som en viktig gren av mikrofluidisk teknik har droppmikrofluidik utvecklats under de senaste åren baserat på traditionella mikrofluidiska system med kontinuerligt flöde. Det är en diskret flödesmikrofluidisk teknik som använder två oblandbara vätskefaser (vanligtvis oljevatten) för att generera dispergerade mikrodroppar och arbeta med dem10. Eftersom mikrodroppar har egenskaperna hos liten volym, stor specifik ytarea, hög intern massöverföringshastighet och ingen korskontaminering orsakad av fackbildning, och fördelarna med stark kontrollerbarhet och hög genomströmning av droppar, har det funnits många typer av forskning som tillämpar droppmikrofluidisk teknik vid odling, screening och utveckling av mikroorganismer med hög genomströmning11 . Det finns dock fortfarande en rad viktiga frågor för att göra droppmikrofluidisk teknik populariserad och allmänt tillämpad. För det första är driften av droppmikrofluidik besvärlig och invecklad, vilket resulterar i höga tekniska krav för operatörer. För det andra kombinerar droppmikrofluidisk teknik optiska, mekaniska och elektriska komponenter och måste associeras med biotekniska applikationsscenarier. Det är svårt för ett enda laboratorium eller team att bygga effektiva droppmikrofluidiska styrsystem om det inte finns något tvärvetenskapligt samarbete. För det tredje, på grund av den lilla volymen mikrodroppe (från picoliter (pL) till mikroliter (μL)), krävs det mycket svårigheter att förverkliga den exakta automatiserade kontrollen och realtidsdetekteringen av droppar för vissa grundläggande mikrobiella operationer som subodling, sortering och provtagning, och det är också svårt att konstruera ett integrerat utrustningssystem12.
För att ta itu med ovanstående problem utvecklades ett automatiskt mikrobiellt mikrodropletodlingssystem (MMC) framgångsrikt baserat på droppmikrofluidisk teknik13. MMC består av fyra funktionella moduler: en droppigenkänningsmodul, en droppspektrumdetekteringsmodul, en mikrofluidisk chipmodul och en provtagningsmodul. Genom systemintegration och kontroll av alla moduler fastställs automatiserat operativsystem inklusive generering, odling, mätning (optisk densitet (OD) och fluorescens), splittring, fusion, sortering av droppar exakt, vilket uppnår integrationen av funktioner som inokulering, odling, övervakning, subodling, sortering och provtagning som krävs av processen för mikrobiell droppodling. MMC kan rymma upp till 200 replikerade droppodlingsenheter med en volym på 2-3 μl, vilket motsvarar 200 odlingsenheter för skakkolvar. Odlingssystemet för mikrodroppar kan uppfylla kraven på icke-kontaminering, upplöst syre, blandning och massenergiutbyte under tillväxten av mikroorganismer och tillgodose de olika behoven hos mikrobiell forskning genom flera integrerade funktioner, till exempel tillväxtkurvmätning, adaptiv evolution, enfaktoranalys på flera nivåer och metabolitforskning och analys (baserat på fluorescensdetektering)13,14.
Här introducerar protokollet hur man använder MMC för att genomföra automatiserad och mikrobiell odling och adaptiv evolution i detalj (Figur 1). Vi tog vildtyp Escherichia coli (E. coli) MG1655 som ett exempel för att demonstrera mätningen av tillväxtkurvan och en metanol-essentiell E. coli-stam MeSV2.215 för att demonstrera den adaptiva utvecklingen i MMC. En operationsprogramvara för MMC utvecklades, vilket gör operationen mycket enkel och tydlig. I hela processen måste användaren förbereda den ursprungliga bakterielösningen, ställa in villkoren för MMC och sedan injicera bakterielösningen och relaterade reagenser i MMC. Därefter kommer MMC automatiskt att utföra operationer som droppgenerering, igenkänning och numrering, odling och adaptiv evolution. Det kommer också att utföra online-detektering (OD och fluorescens) av dropparna med hög tidsupplösning och visa relaterade data (som kan exporteras) i programvaran. Operatören kan stoppa odlingsprocessen när som helst enligt resultaten och extrahera måldropparna för efterföljande experiment. MMC är lätt att använda, förbrukar mindre arbete och reagenser och har relativt hög experimentell genomströmning och god dataparallellitet, vilket har betydande fördelar jämfört med konventionella odlingsmetoder. Det ger en billig, driftsvänlig och robust experimentell plattform för forskare att bedriva relaterad mikrobiell forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll presenterar hur man använder det mikrobiella mikrodropletkultursystemet (MMC) för att utföra automatiserad mikrobiell odling och långsiktig adaptiv evolution. MMC är ett miniatyriserat, automatiserat och mikrobiellt odlingssystem med hög genomströmning. Jämfört med konventionella mikrobiella odlingsmetoder och instrument med hög genomströmning har MMC många fördelar som låg arbets- och reagensförbrukning, enkel drift, onlinedetektering (OD och fluorescens), datainsamling med hög tidsupplö…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Key Research and Development Program of China (2018YFA0901500), National Key Scientific Instrument and Equipment Project från National Natural Science Foundation of China (21627812) och Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20161080108). Vi tackar också prof. Julia A. Vorholt (Institute of Microbiology, Institutionen för biologi, ETH Zürich, Zürich 8093, Schweiz) för tillhandahållandet av den metanol-essentiella E. coli-stammen version 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
Referências
- Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
- Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
- Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
- Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
- Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
- Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
- Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
- Huber, R., et al. Robo-Lector – a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
- Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
- Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
- Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
- Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
- Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
- Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
- Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
- Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
- Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
- Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
- Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
- Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
- Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).
