تصوير المجالات التكرارية في الكروماتين المحفوظ بالبنية الفائقة بواسطة التصوير المقطعي الإلكتروني
Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنية لرسم خرائط عالية الدقة لمواقع النسخ المتماثل في الكروماتين المحفوظ هيكليا في الموقع والذي يستخدم مزيجا من التضمين المسبق لوضع العلامات على EdU-streptavidin-Nanogold و ChromEMT.
Abstract
لا تزال مبادئ طي الحمض النووي في نواة الخلية وتحولاتها الديناميكية التي تحدث أثناء تحقيق الوظائف الجينية الأساسية (النسخ ، النسخ ، التكرار ، الفصل ، إلخ) غير مفهومة بشكل جيد ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود مناهج تجريبية للتصور عالي الدقة لمواقع كروماتين محددة في النوى المحفوظة هيكليا. نقدم هنا بروتوكولا لتصور المجالات التكرارية في زراعة الخلايا أحادية الطبقة في الموقع ، من خلال الجمع بين وضع العلامات EdU للحمض النووي المركب حديثا مع الكشف اللاحق عن الملصقات مع تضخيم Ag لجزيئات Nanogold وتلطيخ ChromEM للكروماتين. يسمح هذا البروتوكول بوضع العلامات قبل التضمين عالية التباين والكفاءة العالية ، والمتوافقة مع تثبيت الجلوتارالدهيد التقليدي الذي يوفر أفضل حفظ هيكلي للكروماتين لمعالجة العينات في درجة حرارة الغرفة. ميزة أخرى لوضع العلامات قبل التضمين هي إمكانية التحديد المسبق للخلايا ذات الأهمية للتقسيم. هذا مهم بشكل خاص لتحليل مجموعات الخلايا غير المتجانسة ، وكذلك التوافق مع نهج التصوير المقطعي الإلكتروني لتحليل 3D عالي الدقة لتنظيم الكروماتين في مواقع النسخ المتماثل ، وتحليل إعادة ترتيب الكروماتين بعد النسخ المتماثل وفصل الكروماتيد الشقيق في الطور البيني.
Introduction
تكرار الحمض النووي هو عملية بيولوجية أساسية مطلوبة للنسخ الأمين ونقل المعلومات الوراثية أثناء انقسام الخلايا. في حقيقيات النوى الأعلى ، يخضع تكرار الحمض النووي لتنظيم مكاني وزماني ضيق ، والذي يتجلى في التنشيط المتسلسل لأصول النسخ المتماثل1. تشكل أصول النسخ المتماثل المجاورة التي تطلق بشكل متزامن مجموعات من النسخ المتماثلة2. على مستوى المجهر الضوئي ، يتم الكشف عن مواقع تكرار الحمض النووي المستمر كبؤر تكرار مختلفة العدد والأحجام. تعرض بؤر النسخ المتماثل أنماطا محددة من التوزيع المكاني داخل نواة الخلية اعتمادا على توقيت تكرار الحمض النووي المسمى 3,4 ، والذي بدوره يرتبط ارتباطا وثيقا بنشاط جيناته. بفضل التسلسل المحدد جيدا لتكرار الحمض النووي ، الذي يتم ترتيبه بدقة في المكان والزمان ، يعد وضع العلامات التكرارية طريقة قوية لوضع العلامات الدقيقة على الحمض النووي ليس فقط لدراسة عملية النسخ المتماثل في حد ذاتها ، ولكن أيضا للتمييز بين جزء فرعي معين من الحمض النووي مع نشاط نسخ محدد ومستوى ضغط. عادة ما يتم تنفيذ تصور تكرار الكروماتين من خلال الكشف عن مكونات البروتين الرئيسية لآلات تكرار الحمض النووي (إما عن طريق التلطيخ المناعي أو عن طريق التعبير عن علامات البروتين الفلورسنت5,6) أو عن طريق دمج سلائف تخليق الحمض النووي المعدلة 7,8,9,10 . من بين هذه الطرق ، فقط الطرق القائمة على دمج النيوكليوتيدات المعدلة في الحمض النووي المكرر حديثا تسمح بالتقاط التغيرات التوافقية في الكروماتين أثناء النسخ المتماثل ، وتتبع سلوك المجالات التكرارية بعد اكتمال تكرارها.
في حقيقيات النوى الأعلى ، يضيف تغليف الحمض النووي في الكروماتين مستوى آخر من التعقيد إلى تنظيم الوظائف الوراثية الأساسية (النسخ ، النسخ المتماثل ، الجبر ، إلخ). يؤثر طي الكروماتين على إمكانية وصول الحمض النووي إلى العوامل التنظيمية العابرة والتغيرات التوافقية للحمض النووي (فك الحلزون المزدوج) المطلوبة لتوليف القالب. لذلك ، من المقبول عموما أن العمليات الاصطناعية المعتمدة على الحمض النووي في نواة الخلية تتطلب انتقالا هيكليا للكروماتين من حالته القمعية المكثفة إلى تشكيل أكثر سهولة وانفتاحا. من الناحية الخلوية ، يتم تعريف هاتين الحالتين الكروماتين على أنهما heterochromatin و euchromatin. ومع ذلك ، لا يوجد حتى الآن توافق في الآراء بشأن طريقة طي الحمض النووي في النواة. تتراوح الفرضيات من نموذج “ذوبان البوليمر”11 ، حيث تتصرف الألياف النووية كبوليمر عشوائي يتم التحكم في كثافة التعبئة له بواسطة آليات فصل الطور ، إلى نماذج قابلة للطي هرمية تفترض التكوين المتسلسل للهياكل الشبيهة بألياف الكروماتين ذات السماكة المتزايدة12,13. اكتسبت نماذج الطي الهرمي مؤخرا دعما من النهج الجزيئية القائمة على تحليل اتصالات الحمض النووي والحمض النووي في الموقع (التقاط تشكيل الكروموسومات ، 3C) ، مما يدل على وجود التسلسل الهرمي للمجالات الهيكلية للكروماتين14. من المهم ملاحظة أن وحدات النسخ المتماثل ترتبط ارتباطا جيدا بمجالات الكروماتين هذه15. ويستند النقد الرئيسي لهذه النماذج إلى تجميع الكروماتين الاصطناعي المحتمل الناجم عن إجراءات إعداد العينات، مثل تخلل أغشية الخلايا وإزالة المكونات غير الكروماتينية، من أجل تحسين تباين الكروماتين للدراسات فوق الهيكلية مع تحسين إمكانية الوصول إلى الكروماتين لمختلف المجسات (مثل الأجسام المضادة). وقد سمحت التطورات التقنية الحديثة في تلطيخ الحمض النووي الانتقائي للفحص المجهري الإلكتروني عن طريق الأكسدة الضوئية بوساطة الفلوروفور المرتبطة بالحمض النووي للديامينوبينزيدين (ChromEMT6) بإزالة هذه العقبة. ومع ذلك ، فإن نفس الاعتبارات تنطبق على تصور المجهر الإلكتروني لتكرار الحمض النووي17,18. هنا نصف تقنية تسمح برسم خرائط فوق هيكلية عالية الدقة في وقت واحد للحمض النووي المركب حديثا والكروماتين الكلي في الخلايا المتقاطعة مع الألدهيد السليمة. تجمع هذه التقنية بين الكشف عن الحمض النووي المسمى EdU بواسطة Click-chemistry مع مجسات البيوتينيل والستربتافيدين نانوغولد و ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتميز الطريقة الموضحة هنا بالعديد من المزايا مقارنة بالبروتوكولات المنشورة مسبقا. أولا ، إن استخدام Click-chemistry لوضع العلامات على الحمض النووي المكرر يلغي الحاجة إلى شرط تمسخ الحمض النووي للكشف عن BrdU بالأجسام المضادة ، وبالتالي الحفاظ على البنية الفائقة للكروماتين بشكل أفضل.
<p class="jove_conten…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مراسلون بلا حدود (المنحة #17-15-01290) و RFBR (المنحة #19-015-00273). يشكر المؤلفون برنامج تطوير جامعة لومونوسوف الحكومية في موسكو (PNR 5.13) ومركز نيكون للتميز في التصوير المرتبط في معهد بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية للوصول إلى أجهزة التصوير.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
