Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica
Summary
Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.
Abstract
Os princípios de dobramento do DNA no núcleo celular e suas transformações dinâmicas que ocorrem durante o cumprimento de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, segregação, etc.) permanecem mal compreendidos, em parte devido à falta de abordagens experimentais para visualização de alta resolução de locis de cromatina específica em núcleos estruturalmente preservados. Aqui apresentamos um protocolo para a visualização de domínios replicativos na cultura de células monocamadas in situ, combinando rotulagem EdU de DNA recém-sintetizado com posterior detecção de rótulo com amplificação ag de partículas nanogold e coloração chromEM de cromatina. Este protocolo permite a rotulagem pré-incorporação de alto contraste e alta eficiência, compatível com a fixação tradicional de glutaraldeído que fornece a melhor preservação estrutural da cromatina para o processamento da amostra de temperatura ambiente. Outra vantagem da rotulagem pré-incorporação é a possibilidade de pré-selecionar células de interesse para secção. Isso é especialmente importante para a análise de populações de células heterogêneas, bem como compatibilidade com abordagens de tomografia eletrônica para análise 3D de alta resolução da organização cromatina em locais de replicação, e a análise do rearranjo pós-replicativo da cromatina e da segregação cromátide irmã na interfase.
Introduction
A replicação do DNA é um processo biológico básico necessário para cópia e transmissão fiel das informações genéticas durante a divisão celular. Em eucariotes mais altos, a replicação de DNA é submetida a uma regulação espátula-temporal apertada, que se manifesta na ativação sequencial das origens de replicação1. Origens de replicação vizinhas disparando sincronizadamente formam aglomerados de replicons2. Ao nível da microscopia óptica, locais de replicação contínua de DNA são detectados como focos de replicação de vários números e tamanhos. Os focos de replicação exibem padrões específicos de distribuição espacial dentro do núcleo celular, dependendo do tempo de replicação do DNArotulado 3,4, que, por sua vez, está fortemente correlacionado com sua atividade genética. Graças à sequência bem definida de replicação de DNA, estritamente ordenada no espaço e no tempo, a rotulagem replicativa é um método poderoso de rotulagem precisa de DNA não apenas para o estudo do processo de replicação em si, mas também para discriminar uma sub fração de DNA específica com atividade de transcrição definida e nível de compactação. A visualização da cromatina replicante é geralmente realizada através da detecção de componentes proteicos principais de máquinas de replicação de DNA (seja por imunostaining ou por expressão de marcas de proteína fluorescente 5,6) ou pela incorporação de precursores de síntese de DNA modificados 7,8,9,10 . Destes, apenas métodos baseados na incorporação de nucleotídeos modificados em DNA recém-replicado permitem a captura de alterações conformais na cromatina durante a replicação, e traçam o comportamento dos domínios replicativos após sua replicação ser concluída.
Em eucariotes mais altos, a embalagem de DNA em cromatina adiciona outro nível de complexidade à regulação de funções genéticas básicas (transcrição, replicação, reparação, etc.). A dobra de cromatina afeta a acessibilidade do DNA a fatores transregulatórios e alterações conformais de DNA (duplo desenrolar de hélice) necessárias para a síntese do modelo. Portanto, é geralmente aceito que processos sintéticos dependentes de DNA no núcleo celular requerem uma transição estrutural da cromatina de seu estado condensado e repressivo para uma conformação mais acessível e aberta. Citologicamente, esses dois estados de cromatina são definidos como heterocromatina e eucromatina. No entanto, ainda não há consenso sobre o modo de dobramento de DNA no núcleo. As hipóteses variam de um modelo11 de “derretimento de polímeros”, onde a fibra nucleosômica se comporta como um polímero aleatório para o qual a densidade de embalagem é controlada por mecanismos de separação de fase, até modelos hierárquicos dobráveis postulando formação sequencial de estruturas de fibras de cromatina de espessura crescente12,13. Modelos hierárquicos dobráveis recentemente ganharam apoio de abordagens moleculares com base na análise de contatos in situ DNA-DNA (captura de conformação cromossomo, 3C), demonstrando a existência da hierarquia dos domínios estruturais da cromatina14. É importante notar que as unidades de replicação se correlacionam muito bem com esses domínios de cromatina15. A maior crítica desses modelos baseia-se na potencial agregação artificial de cromatina causada por procedimentos de preparação de amostras, como permeabilização de membranas celulares e remoção de componentes não cromatinas, a fim de melhorar o contraste da cromatina para estudos ultraestruturais, melhorando a acessibilidade da cromatina para várias sondas (por exemplo, anticorpos). Os recentes avanços técnicos na coloração seletiva de DNA para microscopia eletrônica por foto-oxidação mediada por fluoroforino mediado pelo DNA de diaminobenzidina (ChromEMT6) permitiram a eliminação deste obstáculo. No entanto, as mesmas considerações são verdadeiras para a visualização da microscopia eletrônica da replicação do DNA17,18. Aqui descrevemos uma técnica que permite o mapeamento ultraestrutural de alta resolução simultânea do DNA recém-sintetizado e cromatina total em células intactas cruzadas de aldeído. A técnica combina a detecção de DNA rotulado pela EdU por click-química com sondas biotiniladas e streptavidin-Nanogold, e ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método descrito aqui tem várias vantagens em relação aos protocolos publicados anteriormente. Primeiro, o uso de Click-química para rotular DNA replicado elimina a necessidade de pré-requisito de desnaturação de DNA para detecção de BrdU com anticorpos, preservando assim melhor a ultraestrutura de cromatina.
Em segundo lugar, a utilização da biotina como um ligante secundário que é gerado após a fixação do glutaraldeído e a sacieciação adequada de grupos de aldeído desv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pela RSF (subvenção nº 17-15-01290) e RFBR (subvenção nº 19-015-00273). Os autores agradecem ao programa de desenvolvimento da Universidade Estadual de Moscou Lomonosov (PNR 5.13) e ao Centro de Excelência Nikon em imagens correlativas do Instituto Belozersky de Biologia Físico-Química pelo acesso à instrumentação por imagem.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
