Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography
Summary
Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.
Abstract
Principes van DNA-vouwing in de celkern en de dynamische transformaties die optreden tijdens de vervulling van fundamentele genetische functies (transcriptie, replicatie, segregatie, enz.) blijven slecht begrepen, deels als gevolg van het gebrek aan experimentele benaderingen voor hoge resolutie visualisatie van specifieke chromatine loci in structureel bewaard gebleven kernen. Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie van replicerende domeinen in monolaagcelcultuur in situ, door EdU-labeling van nieuw gesynthetiseerd DNA te combineren met daaropvolgende labeldetectie met Ag-amplificatie van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van chromatine. Dit protocol maakt de contrastrijke, zeer efficiënte pre-embedding etikettering mogelijk, compatibel met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van chromatine biedt voor monsterverwerking op kamertemperatuur. Een ander voordeel van pre-embedding labeling is de mogelijkheid om vooraf cellen te selecteren die van belang zijn voor secties. Dit is vooral belangrijk voor de analyse van heterogene celpopulaties, evenals compatibiliteit met elektronentomografiebenaderingen voor hoge-resolutie 3D-analyse van chromatine-organisatie op replicatieplaatsen, en de analyse van postreplicatieve chromatineherschikking en zusterchromatidenscheiding in de interfase.
Introduction
DNA-replicatie is een fundamenteel biologisch proces dat nodig is voor het getrouw kopiëren en overbrengen van de genetische informatie tijdens de celdeling. Bij hogere eukaryoten wordt DNA-replicatie onderworpen aan een strakke spatio-temporele regulatie, die zich manifesteert in sequentiële activering van replicatieoorsprong1. Naburige replicatieoorsprongen die synchroon worden afgevuurd, vormen clusters van repliconen2. Op het niveau van optische microscopie worden plaatsen van voortdurende DNA-replicatie gedetecteerd als replicatiehaarden van verschillende aantallen en groottes. Replicatiehaarden vertonen specifieke patronen van ruimtelijke verdeling binnen de celkern, afhankelijk van de replicatietiming van het gelabelde DNA 3,4, dat op zijn beurt nauw gecorreleerd is met zijn genactiviteit. Dankzij de goed gedefinieerde sequentie van DNA-replicatie, strikt geordend in ruimte en tijd, is replicative labeling een krachtige methode voor nauwkeurige DNA-labeling, niet alleen voor de studie van het replicatieproces op zich, maar ook om een specifieke DNA-subfractie te onderscheiden met gedefinieerde transcriptieactiviteit en verdichtingsniveau. Visualisatie van replicerend chromatine wordt meestal uitgevoerd door de detectie van belangrijke eiwitcomponenten van DNA-replicatiemachines (hetzij door immunostaining of door expressie van fluorescerende eiwittags 5,6) of door de integratie van gemodificeerde DNA-syntheseprecursoren 7,8,9,10 . Hiervan maken alleen methoden op basis van de opname van gemodificeerde nucleotiden in nieuw gerepliceerd DNA het mogelijk om conformationele veranderingen in chromatine tijdens replicatie vast te leggen en het gedrag van replicerende domeinen te traceren nadat hun replicatie is voltooid.
Bij hogere eukaryoten voegt DNA-verpakking in chromatine een ander niveau van complexiteit toe aan de regulatie van genetische basisfuncties (transcriptie, replicatie, reparatie, enz.). Chromatinevouwing beïnvloedt de toegankelijkheid van DNA tot regulerende transfactoren en DNA-conformatieveranderingen (dubbele helixafwikkeling) die nodig zijn voor de sjabloonsynthese. Daarom wordt algemeen aanvaard dat DNA-afhankelijke synthetische processen in de celkern een structurele overgang van chromatine vereisen van zijn gecondenseerde, repressieve toestand naar een meer toegankelijke, open conformatie. Cytologisch worden deze twee chromatinetoestanden gedefinieerd als heterochromatine en euchromatine. Er is echter nog steeds geen consensus over de wijze van DNA-vouwing in de kern. De hypothesen variëren van een “polymeersmelt” model11, waarbij nucleosomale vezel zich gedraagt als een willekeurig polymeer waarvoor de pakkingsdichtheid wordt geregeld door fasescheidingsmechanismen, tot hiërarchische vouwmodellen die sequentiële vorming van chromatinevezelachtige structuren van toenemende diktepostuleren 12,13. Hiërarchische vouwmodellen kregen onlangs steun van moleculaire benaderingen op basis van de analyse van in situ DNA-DNA-contacten (chromosoomconformatievangst, 3C), wat het bestaan van de hiërarchie van chromatine structurele domeinen14 aantoont. Het is belangrijk op te merken dat replicatie-eenheden zeer goed correleren met deze chromatinedomeinen15. De belangrijkste kritiek op deze modellen is gebaseerd op mogelijke kunstmatige chromatineaggregatie veroorzaakt door monstervoorbereidingsprocedures, zoals permeabilisatie van celmembranen en verwijdering van niet-chromatinecomponenten, om het chromatinecontrast voor ultrastructurele studies te verbeteren en tegelijkertijd de toegankelijkheid van chromatine voor verschillende probes (bijv. Antilichamen) te verbeteren. Recente technische vooruitgang in selectieve DNA-kleuring voor elektronenmicroscopie door DNA-bindende fluorofoor-gemedieerde foto-oxidatie van diaminobenzidine (ChromEMT6) heeft de eliminatie van dit obstakel mogelijk gemaakt. Dezelfde overwegingen gelden echter voor elektronenmicroscopievisualisatie van het repliceren van DNA17,18. Hier beschrijven we een techniek die het mogelijk maakt om tegelijkertijd ultrastructurele mapping met hoge resolutie nieuw gesynthetiseerd DNA en totaal chromatine in intacte aldehyde-gekruiste cellen mogelijk te maken. De techniek combineert detectie van EdU-gelabeld DNA door Click-chemie met gebiotinyleerde probes en streptavidin-Nanogold en ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen. Ten eerste elimineert het gebruik van Click-chemie voor het labelen van gerepliceerd DNA de noodzaak van DNA-denaturatievoorwaarde voor BrdU-detectie met antilichamen, waardoor chromatine ultrastructuur beter behouden blijft.
Ten tweede minimaliseert het gebruik van biotine als secundair ligand dat wordt gegenereerd na glutaaraldehydefixatie en het correct blussen van ongebonden aldehyd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels ondersteund door RSF (subsidie #17-15-01290) en RFBR (subsidie #19-015-00273). De auteurs bedanken lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) en Nikon Center of Excellence in correlative imaging aan het Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology voor toegang tot beeldvormingsinstrumenten.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
