Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique
Summary
Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.
Abstract
Les principes du repliement de l’ADN dans le noyau cellulaire et ses transformations dynamiques qui se produisent lors de l’accomplissement des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, ségrégation, etc.) restent mal compris, en partie en raison du manque d’approches expérimentales de visualisation à haute résolution de loci de chromatine spécifiques dans des noyaux structurellement préservés. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation des domaines réplicatifs dans la culture cellulaire monocouche in situ, en combinant le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé avec la détection ultérieure du marquage avec l’amplification Ag des particules Nanogold et la coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole permet l’étiquetage pré-intégration à contraste élevé et à haute efficacité, compatible avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui offre la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement des échantillons à température ambiante. Un autre avantage de l’étiquetage de pré-intégration est la possibilité de présélectionner les cellules d’intérêt pour la section. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de populations cellulaires hétérogènes, ainsi que pour la compatibilité avec les approches de tomographie électronique pour l’analyse 3D à haute résolution de l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, et l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine et de la ségrégation des chromatides sœurs dans l’interphase.
Introduction
La réplication de l’ADN est un processus biologique de base requis pour la copie fidèle et la transmission de l’information génétique pendant la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l’ADN est soumise à une régulation spatio-temporelle étroite, qui se manifeste par une activation séquentielle des origines de la réplication1. Les origines de réplication voisines tirant de manière synchrone forment des groupes de replicons2. Au niveau de la microscopie optique, les sites de réplication continue de l’ADN sont détectés comme des foyers de réplication de nombre et de taille variés. Les foyers de réplication présentent des modèles spécifiques de distribution spatiale dans le noyau cellulaire en fonction du moment de la réplication de l’ADN marqué 3,4, qui, à son tour, est étroitement corrélé avec son activité génique. Grâce à une séquence bien définie de réplication de l’ADN, strictement ordonnée dans l’espace et le temps, le marquage réplicatif est une méthode puissante de marquage précis de l’ADN non seulement pour l’étude du processus de réplication en soi, mais aussi pour discriminer une sous-fraction spécifique de l’ADN avec une activité de transcription et un niveau de compactage définis. La visualisation de la chromatine répliquante est généralement réalisée par la détection des principaux composants protéiques de la machinerie de réplication de l’ADN (soit par immunocoloration, soit par expression de marqueurs de protéines fluorescentes 5,6) ou par l’incorporation de précurseurs modifiés de synthèse de l’ADN 7,8,9,10 . Parmi celles-ci, seules les méthodes basées sur l’incorporation de nucléotides modifiés dans l’ADN nouvellement répliqué permettent de capturer les changements conformationnels de la chromatine pendant la réplication et de retracer le comportement des domaines réplicatifs une fois leur réplication terminée.
Chez les eucaryotes supérieurs, l’emballage de l’ADN en chromatine ajoute un autre niveau de complexité à la régulation des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, réparation, etc.). Le repliement de la chromatine affecte l’accessibilité de l’ADN aux transfacteurs régulateurs et aux changements conformationnels de l’ADN (dénouement en double hélice) nécessaires à la synthèse du gabarit. Par conséquent, il est généralement admis que les processus synthétiques dépendants de l’ADN dans le noyau cellulaire nécessitent une transition structurelle de la chromatine de son état condensé et répressif vers une conformation plus accessible et ouverte. Cytologiquement, ces deux états de chromatine sont définis comme l’hétérochromatine et l’euchromatine. Cependant, il n’y a toujours pas de consensus concernant le mode de repliement de l’ADN dans le noyau. Les hypothèses vont d’un modèle de « polymère fondu »11, où la fibre nucléosomique se comporte comme un polymère aléatoire pour lequel la densité d’emballage est contrôlée par des mécanismes de séparation de phase, à des modèles de pliage hiérarchique postulant la formation séquentielle de structures ressemblant à des fibres de chromatine d’épaisseur croissante12,13. Les modèles de repliement hiérarchique ont récemment été soutenus par des approches moléculaires basées sur l’analyse des contacts ADN-ADN in situ (capture de conformation chromosomique, 3C), démontrant l’existence de la hiérarchie des domaines structurels de la chromatine14. Il est important de noter que les unités de réplication sont très bien corrélées à ces domaines de la chromatine15. La principale critique de ces modèles est basée sur l’agrégation potentielle de la chromatine artificielle causée par les procédures de préparation des échantillons, telles que la perméabilisation des membranes cellulaires et l’élimination des composants non chromatines, afin d’améliorer le contraste de la chromatine pour les études ultrastructurales tout en améliorant l’accessibilité de la chromatine pour diverses sondes (par exemple, les anticorps). Les progrès techniques récents dans la coloration sélective de l’ADN pour la microscopie électronique par photo-oxydation de la diaminobenzidine médiée par fluorophore liant l’ADN (ChromEMT6) ont permis d’éliminer cet obstacle. Cependant, les mêmes considérations sont vraies pour la visualisation par microscopie électronique de l’ADNrépliqué 17,18. Nous décrivons ici une technique qui permet la cartographie ultrastructurale simultanée à haute résolution de l’ADN nouvellement synthétisé et de la chromatine totale dans des cellules réticulées au aldéhyde intactes. La technique combine la détection de l’ADN marqué EdU par Click-chemistry avec des sondes biotinylées et streptavidin-Nanogold, et ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédemment publiés. Tout d’abord, l’utilisation de la chimie du clic pour le marquage de l’ADN répliqué élimine la nécessité d’une dénaturation de l’ADN préalable à la détection de BrdU avec des anticorps, préservant ainsi mieux l’ultrastructure de la chromatine.
Deuxièmement, l’utilisation de la biotine comme ligand secondaire généré après la fixation du glutaraldéhyde et la t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par RSF (subvention #17-15-01290) et RFBR (subvention #19-015-00273). Les auteurs remercient le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou (PNR 5.13) et le Centre d’excellence Nikon en imagerie corrélative de l’Institut Belozersky de biologie physico-chimique pour leur accès à l’instrumentation d’imagerie.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
