Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie
Summary
Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.
Abstract
Die Prinzipien der DNA-Faltung im Zellkern und ihre dynamischen Transformationen, die während der Erfüllung grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Segregation usw.) auftreten, sind nach wie vor wenig verstanden, was zum Teil auf das Fehlen experimenteller Ansätze zur hochauflösenden Visualisierung spezifischer Chromatinorte in strukturell konservierten Kernen zurückzuführen ist. Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung replitiver Domänen in Monolayer-Zellkultur in situ vor, indem wir die EdU-Markierung neu synthetisierter DNA mit anschließender Markierungsdetektion mit Ag-Amplifikation von Nanogoldpartikeln und ChromEM-Färbung von Chromatin kombinieren. Dieses Protokoll ermöglicht die kontrastreiche, hocheffiziente Voreinbettungsmarkierung, die mit der traditionellen Glutaraldehydfixierung kompatibel ist und die beste strukturelle Konservierung von Chromatin für die Probenverarbeitung bei Raumtemperatur bietet. Ein weiterer Vorteil der Prä-Embedding-Kennzeichnung ist die Möglichkeit, Zellen von Interesse für die Schnittaufnahme vorzuselektieren. Dies ist besonders wichtig für die Analyse heterogener Zellpopulationen sowie für die Kompatibilität mit elektronentomographischen Ansätzen zur hochauflösenden 3D-Analyse der Chromatinorganisation an Replikationsstellen und zur Analyse der postreplizierenden Chromatin-Neuanordnung und Schwesterchromatid-Segregation in der Interphase.
Introduction
Die DNA-Replikation ist ein grundlegender biologischer Prozess, der für das originalgetreue Kopieren und Übertragen der genetischen Information während der Zellteilung erforderlich ist. Bei höheren Eukaryoten unterliegt die DNA-Replikation einer engen räumlich-zeitlichen Regulation, die sich in einer sequentiellen Aktivierung der Replikationsursprüngemanifestiert 1. Benachbarte Replikationsursprünge, die synchron ausgelöst werden, bilden Cluster von replicons2. Auf der Ebene der optischen Mikroskopie werden Stellen der laufenden DNA-Replikation als Replikationsherde unterschiedlicher Anzahl und Größe nachgewiesen. Replikationsherde zeigen spezifische Muster der räumlichen Verteilung innerhalb des Zellkerns, abhängig vom Replikationszeitpunkt der markierten DNA3,4, die wiederum eng mit ihrer Genaktivität korreliert ist. Dank der klar definierten Sequenz der DNA-Replikation, die streng in Raum und Zeit geordnet ist, ist die replizierende Markierung eine leistungsstarke Methode der präzisen DNA-Markierung nicht nur für die Untersuchung des Replikationsprozesses an sich, sondern auch zur Unterscheidung einer spezifischen DNA-Unterfraktion mit definierter Transkriptionsaktivität und Verdichtungsebene. Die Visualisierung von replizierendem Chromatin erfolgt in der Regel durch den Nachweis von Hauptproteinkomponenten der DNA-Replikationsmaschinerie (entweder durch Immunfärbung oder durch Expression fluoreszierender Protein-Tags5,6) oder durch die Einbeziehung modifizierter DNA-Synthesevorläufer 7,8,9,10 . Von diesen ermöglichen nur Methoden, die auf der Einarbeitung modifizierter Nukleotide in neu replizierte DNA basieren, die Erfassung von Konformationsänderungen im Chromatin während der Replikation und verfolgen das Verhalten replizierender Domänen nach Abschluss ihrer Replikation.
In höheren Eukaryoten fügt die DNA-Verpackung in Chromatin der Regulation grundlegender genetischer Funktionen (Transkription, Replikation, Reparation usw.) eine weitere Ebene der Komplexität hinzu. Die Chromatinfaltung beeinflusst die Zugänglichkeit der DNA zu regulatorischen Transfaktoren und DNA-Konformationsänderungen (Doppelhelix-Abwicklung), die für die Template-Synthese erforderlich sind. Daher ist es allgemein anerkannt, dass DNA-abhängige synthetische Prozesse im Zellkern einen strukturellen Übergang von Chromatin von seinem kondensierten, repressiven Zustand zu einer zugänglicheren, offenen Konformation erfordern. Zytologisch sind diese beiden Chromatinzustände als Heterochromatin und Euchromatin definiert. Es gibt jedoch immer noch keinen Konsens über die Art und Weise der DNA-Faltung im Zellkern. Die Hypothesen reichen von einem “Polymerschmelze” -Modell11, bei dem sich die nukleosomale Faser wie ein zufälliges Polymer verhält, bei dem die Packungsdichte durch Phasentrennungsmechanismen gesteuert wird, bis hin zu hierarchischen Faltungsmodellen, die die sequentielle Bildung von chromatinfaserähnlichen Strukturen mit zunehmender Dicke postulieren12,13. Hierarchische Faltungsmodelle haben kürzlich Unterstützung durch molekulare Ansätze erhalten, die auf der Analyse von In-situ-DNA-DNA-Kontakten (Chromosomenkonformationsabscheidung, 3C) basieren und die Existenz der Hierarchie der strukturellen Chromatindomänendemonstrieren 14. Es ist wichtig zu beachten, dass Replikationseinheiten sehr gut mit diesen Chromatindomänen korrelieren15. Die Hauptkritik an diesen Modellen basiert auf der potenziellen künstlichen Chromatinaggregation, die durch Probenvorbereitungsverfahren wie die Permeabilisierung von Zellmembranen und die Entfernung von Nicht-Chromatin-Komponenten verursacht wird, um den Chromatinkontrast für ultrastrukturelle Studien zu verbessern und gleichzeitig die Chromatin-Zugänglichkeit für verschiedene Sonden (z. B. Antikörper) zu verbessern. Jüngste technische Fortschritte bei der selektiven DNA-Färbung für die Elektronenmikroskopie durch DNA-bindende fluorophorvermittelte Photooxidation von Diaminobenzidin (ChromEMT6) haben die Beseitigung dieses Hindernisses ermöglicht. Die gleichen Überlegungen gelten jedoch für die elektronenmikroskopische Visualisierung der sich replizierenden DNA17,18. Hier beschreiben wir eine Technik, die die gleichzeitige hochauflösende ultrastrukturelle Kartierung von neu synthetisierter DNA und Gesamtchromatin in intakten aldehydvernetzten Zellen ermöglicht. Die Technik kombiniert den Nachweis von EdU-markierter DNA durch Click-Chemie mit biotinylierten Sonden und Streptavidin-Nanogold und ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene Methode hat mehrere Vorteile gegenüber zuvor veröffentlichten Protokollen. Erstens eliminiert die Verwendung der Click-Chemie zur Markierung replizierter DNA die Notwendigkeit der DNA-Denaturierung, die für den BrdU-Nachweis mit Antikörpern erforderlich ist, wodurch die Chromatin-Ultrastruktur besser erhalten wird.
Zweitens minimiert die Verwendung von Biotin als sekundärer Ligand, der nach der Glutaraldehydfixierung und dem ordnungsgemäßen Abschrecken von ungebun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil von RSF (Grant #17-15-01290) und RFBR (Grant #19-015-00273) unterstützt. Die Autoren danken dem Lomonosov Moscow State University Development Program (PNR 5.13) und dem Nikon Center of Excellence in korrelativer Bildgebung am Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology für den Zugang zu bildgebenden Instrumenten.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
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