הדמיה תחומים משכפלים בכרומטין אולטרה מובנה על ידי טומוגרפיה אלקטרונית
Summary
פרוטוקול זה מציג טכניקה למיפוי ברזולוציה גבוהה של אתרי שכפול בכרומטין שהשתמר מבנית במקום המשתמש בשילוב של תיוג EdU-streptavidin-Nanogold טרום הטמעה וכרוממט.
Abstract
עקרונות קיפול DNA בגרעין התא והשינויים הדינמיים שלו המתרחשים במהלך מילוי פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, הפרדה וכו ‘) נשארים מובנים היטב, בין היתר בשל היעדר גישות ניסיוניות להדמיה ברזולוציה גבוהה של לוצי כרומטין ספציפי בגרעינים שהשתמרו מבנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה של תחומים משוכפלים בתרבית תאים מונולאיים במקום, על ידי שילוב תיוג EdU של DNA מסונתז חדש עם זיהוי תווית עוקב עם Ag-הגברה של חלקיקי ננוגולד וכרום הכתמת כרומטין. פרוטוקול זה מאפשר תיוג טרום הטמעה בעל ניגודיות גבוהה ויעילות גבוהה, התואם לקיבעון גלוטרדהיד מסורתי המספק את השימור המבני הטוב ביותר של כרומטין לעיבוד מדגם בטמפרטורת החדר. יתרון נוסף של תיוג טרום הטבעה הוא האפשרות לבחור מראש תאים מעניינים עבור חלוקה. זה חשוב במיוחד לניתוח של אוכלוסיות תאים הטרוגניים, כמו גם תאימות עם גישות טומוגרפיה אלקטרונים לניתוח תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של ארגון כרומטין באתרי שכפול, וניתוח של ארגון כרומטין לאחר שכפול, וניתוח של ארגון מחדש של כרומטין לאחר שכפול והפרדה כרומטית אחות באינטרפאזה.
Introduction
שכפול DNA הוא תהליך ביולוגי בסיסי הנדרש להעתקה והעברה נאמנה של המידע הגנטי במהלך חלוקת התאים. באוקריוטים גבוהים יותר, שכפול DNA כפוף לרגולציה מרחבית-זמנית הדוקה, המתבטאת בהפעלה רציפה של מקורותהשכפול 1. מקורות שכפול שכנים ירי באופן סינכרוני טופס אשכולות של replicons2. ברמה של מיקרוסקופיה אופטית, אתרים של שכפול DNA מתמשך מזוהים כמו מוקדי שכפול של מספר וגודל שונים. מוקדי שכפול מציגים דפוסים ספציפיים של התפלגות מרחבית בתוך גרעין התא בהתאם לתזמון השכפול של ה- DNAהמסומן בתווית 3,4, אשר, בתורו, מתואם היטב עם פעילות הגנים שלו. הודות לרצף מוגדר היטב של שכפול DNA, מסודר בקפדנות בחלל ובזמן, תיוג שכפול היא שיטה רבת עוצמה של תיוג DNA מדויק לא רק לחקר תהליך השכפול כשלעצמו, אלא גם להפלות תת-שבר DNA ספציפי עם פעילות שעתוק מוגדרת ורמת דחיסה. הדמיה של שכפול כרומטין מבוצעת בדרך כלל באמצעות זיהוי רכיבי חלבון עיקריים של מכונות שכפול DNA (או על ידי חיסון או על ידי ביטוי של תגי חלבון פלואורסצנטיים 5,6) או על ידי שילוב של מבשרי סינתזת DNA שונה 7,8,9,10 . מתוכם, רק שיטות המבוססות על שילוב של נוקלאוטידים שהשתנו בדנ”א ששוכפל לאחרונה מאפשרות לכידת שינויים קונפורמציה בכרומטין במהלך השכפול, ומעקב אחר אופן הפעולה של תחומים משוכפלים לאחר השלמת השכפול שלהם.
באאוקריוטים גבוהים יותר, אריזות DNA לכרומטין מוסיפות רמה נוספת של מורכבות לוויסות פונקציות גנטיות בסיסיות (שעתוק, שכפול, פיצוי וכו ‘). קיפול הכרומטין משפיע על נגישות הדנ”א לטרנס-גורמים רגולטוריים ושינויים קונפורמיים בדנ”א (התרופפות סליל כפול) הנדרשים לסינתזת התבנית. לכן, מקובל כי תהליכים סינתטיים תלויי DNA בגרעין התא דורשים מעבר מבני של כרומטין ממצבו המרוכז והדכאני לקונפורמציה נגישה ופתוחה יותר. מבחינה ציטולוגית, שני מצבים כרומטין אלה מוגדרים כהטרוכרומטין ואאוכרומטין. עם זאת, עדיין אין קונצנזוס לגבי אופן קיפול ה- DNA בגרעין. ההשערות נעות בין “פולימר נמס” מודל11, שבו סיבים נוקלאוזומיים מתנהגים כפולימר אקראי שעבורו צפיפות האריזה נשלטת על ידי מנגנוני הפרדת פאזה, למודלים מתקפלים היררכיים המניחים היווצרות רציפה של מבנים דמויי סיבי כרומטין של עובי הולך וגדל12,13. מודלים קיפול היררכיים זכו לאחרונה לתמיכה בגישות מולקולריות המבוססות על ניתוח מגעי DNA-DNA-DNA (לכידת קונפורמציה כרומוזומית, 3C), הממחישים את קיומה של ההיררכיה של תחומים מבניים כרומטין14. חשוב לציין כי יחידות שכפול לתאם היטב לתחומים כרומטין אלה15. הביקורת העיקרית על מודלים אלה מבוססת על צבירת כרומטין מלאכותית פוטנציאלית הנגרמת על ידי הליכי הכנת מדגם, כגון permeabilization של קרום התא והסרת רכיבים שאינם כרומטין, על מנת לשפר את ניגודיות הכרומטין למחקרים אולטרה מובנים תוך שיפור נגישות הכרומטין לבדיקות שונות (למשל, נוגדנים). ההתקדמות הטכנית האחרונה בהכתמת DNA סלקטיבית למיקרוסקופיה אלקטרונית על ידי חמצון צילום בתיווך פלואורופור מחייב DNA של דיאמינובנזידין (ChromEMT6) אפשרה את חיסול המכשול הזה. עם זאת, אותם שיקולים נכונים להדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים של שכפול DNA 17,18. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת מיפוי אולטרה-מבני ברזולוציה גבוהה בו זמנית של דנ”א מסונתז חדש וכרום מוחלט בתאים שלמים המחוברים לאלדהיד. הטכניקה משלבת זיהוי של DNA שכותרתו EdU על ידי קליק-כימיה עם בדיקות biotinylated וסטרפטאבידין-Nanogold, ו ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
לשיטה המתוארת כאן יש מספר יתרונות על פני פרוטוקולים שפורסמו בעבר. ראשית, השימוש ב-Click-chemistry לתיוג דנ”א משוכפל מבטל את הצורך בדנטורציה של DNA תנאי מוקדם לגילוי BrdU עם נוגדנים, ובכך לשפר את המבנה האולטרה-מבנה של הכרומטין.
שנית, ניצול הביוטין כליגנד משני שנוצר לאחר קיבוע glutaraldehyde ומ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי RSF (מענק #17-15-01290) ו- RFBR (מענק #19-015-00273). המחברים מודים לתוכנית הפיתוח של אוניברסיטת המדינה לומונוסוב מוסקבה (PNR 5.13) ולמרכז ניקון למצוינות בהדמיה קורלטיבית במכון בלוזרסקי לביולוגיה פיזיקלית-כימית על הגישה למכוני הדמיה.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
