इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी द्वारा अल्ट्रास्ट्रक्चरल रूप से संरक्षित क्रोमैटिन में इमेजिंग रेप्लिकेटिव डोमेन
Summary
यह प्रोटोकॉल संरचनात्मक रूप से संरक्षित क्रोमैटिन इन सीटू में प्रतिकृति साइटों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मैपिंग के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है जो ईडीयू-स्ट्रेप्टाविडिन-नैनोगोल्ड लेबलिंग और क्रोमेएमटी को पूर्व-एम्बेडिंग के संयोजन को नियोजित करता है।
Abstract
सेल नाभिक में डीएनए तह के सिद्धांत और इसके गतिशील परिवर्तन जो बुनियादी आनुवंशिक कार्यों (प्रतिलेखन, प्रतिकृति, अलगाव, आदि) की पूर्ति के दौरान होते हैं, आंशिक रूप से संरचनात्मक रूप से संरक्षित नाभिक में विशिष्ट क्रोमैटिन लोकी के उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की कमी के कारण खराब रूप से समझे जाते हैं। यहां हम सीटू में मोनोलेयर सेल संस्कृति में प्रतिकृति डोमेन के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, नैनोगोल्ड कणों के एजी-प्रवर्धन और क्रोमैटिन के क्रोमईएम स्टेनिंग के साथ बाद के लेबल का पता लगाने के साथ नए संश्लेषित डीएनए के ईडीयू लेबलिंग के संयोजन से। यह प्रोटोकॉल उच्च-विपरीत, उच्च-दक्षता पूर्व-एम्बेडिंग लेबलिंग के लिए अनुमति देता है, जो पारंपरिक ग्लूटाराल्डिहाइड निर्धारण के साथ संगत है जो कमरे के तापमान के नमूने के प्रसंस्करण के लिए क्रोमैटिन का सबसे अच्छा संरचनात्मक संरक्षण प्रदान करता है। पूर्व एम्बेडिंग लेबलिंग का एक और लाभ सेक्शनिंग के लिए ब्याज की कोशिकाओं का पूर्व-चयन करने की संभावना है। यह विशेष रूप से विषम सेल आबादी के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, साथ ही साथ प्रतिकृति की साइटों पर क्रोमैटिन संगठन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी विश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी दृष्टिकोण के साथ संगतता, और इंटरफेज में पोस्ट-रेप्लिकेटिव क्रोमैटिन पुनर्व्यवस्था और बहन क्रोमैटिड अलगाव का विश्लेषण।
Introduction
डीएनए प्रतिकृति एक बुनियादी जैविक प्रक्रिया है जो सेल विभाजन के दौरान आनुवंशिक जानकारी की वफादार प्रतिलिपि और संचरण के लिए आवश्यक है। उच्च यूकेरियोट्स में, डीएनए प्रतिकृति को तंग स्पैटियो-टेम्पोरल विनियमन के अधीन किया जाता है, जो प्रतिकृति मूल1 के अनुक्रमिक सक्रियण में प्रकट होता है। पड़ोसी प्रतिकृति मूल फायरिंग तुल्यकालिक रूप से replicons2 के क्लस्टर फार्म। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के स्तर पर, चल रहे डीएनए प्रतिकृति की साइटों को विभिन्न संख्या और आकार के प्रतिकृति फोकी के रूप में पाया जाता है। प्रतिकृति फोकी लेबल किए गए डीएनए 3,4 के प्रतिकृति समय के आधार पर सेल नाभिक के भीतर स्थानिक वितरण के विशिष्ट पैटर्न प्रदर्शित करती है, जो बदले में, इसकी जीन गतिविधि के साथ कसकर सहसंबद्ध है। डीएनए प्रतिकृति के अच्छी तरह से परिभाषित अनुक्रम के लिए धन्यवाद, अंतरिक्ष और समय में सख्ती से आदेश दिया गया है, प्रतिकृति लेबलिंग सटीक डीएनए लेबलिंग का एक शक्तिशाली तरीका है, न केवल प्रतिकृति प्रक्रिया के अध्ययन के लिए, बल्कि परिभाषित प्रतिलेखन गतिविधि और संघनन स्तर के साथ एक विशिष्ट डीएनए उप-अंश को भेदभाव करने के लिए भी। क्रोमैटिन की प्रतिकृति का विज़ुअलाइज़ेशन आमतौर पर डीएनए प्रतिकृति मशीनरी के प्रमुख प्रोटीन घटकों का पता लगाने के माध्यम से किया जाता है (या तो इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा या फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग 5,6 की अभिव्यक्ति द्वारा) या संशोधित डीएनए संश्लेषण अग्रदूतों 7,8,9,10 के निगमन द्वारा . इनमें से, केवल नए दोहराए गए डीएनए में संशोधित न्यूक्लियोटाइड्स के समावेश के आधार पर विधियां प्रतिकृति के दौरान क्रोमैटिन में संरचनात्मक परिवर्तनों को पकड़ने की अनुमति देती हैं, और उनकी प्रतिकृति पूरी होने के बाद प्रतिकृति डोमेन के व्यवहार का पता लगाती हैं।
उच्च यूकेरियोट्स में, क्रोमैटिन में डीएनए पैकेजिंग बुनियादी आनुवंशिक कार्यों (प्रतिलेखन, प्रतिकृति, क्षतिपूर्ति, आदि) के विनियमन में जटिलता का एक और स्तर जोड़ती है। क्रोमैटिन तह नियामक ट्रांस-कारकों और टेम्पलेट संश्लेषण के लिए आवश्यक डीएनए संरचनात्मक परिवर्तनों (डबल हेलिक्स अनवाइंडिंग) के लिए डीएनए की पहुंच को प्रभावित करता है। इसलिए, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि सेल नाभिक में डीएनए-निर्भर सिंथेटिक प्रक्रियाओं को क्रोमैटिन के संरचनात्मक संक्रमण की आवश्यकता होती है, इसकी संघनित, दमनकारी स्थिति से अधिक सुलभ, खुली संरचना के लिए। साइटोलॉजिकल रूप से, इन दो क्रोमैटिन राज्यों को हेटरोक्रोमैटिन और यूक्रोमैटिन के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, नाभिक में डीएनए तह के मोड के बारे में अभी भी कोई आम सहमति नहीं है। परिकल्पनाएं एक “बहुलक पिघल” मॉडल11 से लेकर हैं, जहां न्यूक्लियोसोमल फाइबर एक यादृच्छिक बहुलक के रूप में व्यवहार करता है जिसके लिए पैकिंग घनत्व को चरण पृथक्करण तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है, पदानुक्रमित तह मॉडल क्रोमैटिन फाइबर जैसी संरचनाओं के अनुक्रमिक गठन के बादबढ़ती मोटाई 12,13 के लिए। पदानुक्रमित तह मॉडल ने हाल ही में इन सीटू डीएनए-डीएनए संपर्कों (गुणसूत्र संरचना कैप्चर, 3 सी) के विश्लेषण के आधार पर आणविक दृष्टिकोण से समर्थन प्राप्त किया, जो क्रोमैटिन संरचनात्मक डोमेन14 के पदानुक्रम के अस्तित्व का प्रदर्शन करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रतिकृति इकाइयां इन क्रोमैटिन डोमेन15 के लिए बहुत अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। इन मॉडलों की प्रमुख आलोचना नमूना तैयारी प्रक्रियाओं के कारण संभावित कृत्रिम क्रोमैटिन एकत्रीकरण पर आधारित है, जैसे कि सेल झिल्ली का permeabilization और गैर-क्रोमैटिन घटकों को हटाने, ताकि अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययनों के लिए क्रोमैटिन कंट्रास्ट में सुधार किया जा सके, जबकि विभिन्न जांचों (जैसे, एंटीबॉडी) के लिए क्रोमैटिन पहुंच में सुधार किया जा सके। डीएनए-बाइंडिंग फ्लोरोफोर-मध्यस्थता फोटो-ऑक्सीकरण द्वारा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए चयनात्मक डीएनए धुंधला में हाल ही में तकनीकी प्रगति डायमिनोबेन्जिडीन (क्रोमेएमटी6) ने इस बाधा के उन्मूलन के लिए अनुमति दी है। हालांकि, डीएनए17,18 की प्रतिकृति के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक ही विचार सच है। यहां हम एक ऐसी तकनीक का वर्णन करते हैं जो बरकरार एल्डिहाइड-क्रॉसलिंक्ड कोशिकाओं में नए संश्लेषित डीएनए और कुल क्रोमैटिन के एक साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन अल्ट्रास्ट्रक्चरल मैपिंग की अनुमति देती है। तकनीक Biotinylated जांच और स्ट्रेप्टाविडिन-Nanogold, और क्रोमेएमटी के साथ क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा EdU-लेबल डीएनए का पता लगाने को जोड़ती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित विधि में पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं। सबसे पहले, दोहराए गए डीएनए को लेबल करने के लिए क्लिक-रसायन विज्ञान का उपयोग एंटीबॉडी के साथ बीआरडीयू का पता लगाने के लिए डीएनए विकृतीकरण श?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को RSF (अनुदान # 17-15-01290) और RFBR (अनुदान # 19-015-00273) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। लेखकों Lomonosov मास्को राज्य विश्वविद्यालय विकास कार्यक्रम (PNR 5.13) और Nikon उत्कृष्टता के केंद्र को धन्यवाद Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology में correlative इमेजिंग में इमेजिंग इंस्ट्रूमेंटेशन तक पहुंच के लिए।
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
