전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징
Summary
이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.
Abstract
세포 핵에서 DNA 폴딩의 원리와 기본적인 유전 기능 (전사, 복제, 분리 등)의 이행 중에 발생하는 동적 변형은 부분적으로 구조적으로 보존 된 핵에서 특정 염색질 유전자좌의 고해상도 시각화에 대한 실험 접근법이 부족하기 때문에 잘 이해되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 새로 합성 된 DNA의 EdU 표지와 나노 골드 입자의 Ag 증폭 및 크로마틴의 ChromEM 염색을 통한 후속 라벨 검출을 결합하여 단층 세포 배양물 에서 복제 도메인을 시각화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 상온 시료 처리를 위한 크로마틴의 최상의 구조적 보존을 제공하는 전통적인 글루타르알데히드 고정과 호환되는 고대비, 고효율 사전 임베딩 라벨링을 가능하게 합니다. 라벨링을 사전 임베딩하는 또 다른 이점은 단면화를 위해 관심있는 세포를 미리 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이종 세포 집단의 분석뿐만 아니라 복제 부위에서 크로마틴 조직의 고해상도 3D 분석에 대한 전자 단층 촬영 접근법과의 호환성, 복제 후 크로마틴 재배열 및 자매 염색질 분리의 분석에 특히 중요합니다.
Introduction
DNA 복제는 세포 분열 동안 유전 정보의 충실한 복사 및 전달에 필요한 기본적인 생물학적 과정입니다. 고등 진핵생물에서, DNA 복제는 엄격한 시공간-시간적 조절을 받게 되며, 이는 복제 기원의 순차적 활성화로 나타난다1. 이웃 복제 기원은 동기적으로 발사되어 replicons2의 클러스터를 형성합니다. 광학 현미경 검사의 수준에서, 진행중인 DNA 복제 부위는 다양한 수와 크기의 복제 초점으로 검출됩니다. 복제 초점은 표지된 DNA 3,4의 복제 타이밍에 따라 세포 핵 내 공간 분포의 특정 패턴을 표시하며, 이는 차례로 유전자 활성과 밀접한 상관 관계가 있다. 공간과 시간에 엄격하게 정렬된 잘 정의된 DNA 복제 시퀀스 덕분에, 복제 표지는 복제 과정 그 자체에 대한 연구뿐만 아니라 전사 활성 및 압축 수준이 정의된 특정 DNA 하위 분획을 구별하는 강력한 DNA 표지 방법입니다. 복제 크로마틴의 시각화는 일반적으로 DNA 복제 기계의 주요 단백질 성분 검출 (면역 염색 또는 형광 단백질 태그5,6의 발현) 또는 변형 된 DNA 합성 전구체 7,8,9,10의 혼입을 통해 수행됩니다. . 이들 중에서, 변형된 뉴클레오티드를 새로 복제된 DNA에 혼입하는 것에 기초한 방법만이 복제 동안 크로마틴의 형태적 변화의 포획을 허용하고, 복제가 완료된 후 복제 도메인의 거동을 추적한다.
고등 진핵생물에서 염색질로의 DNA 패키징은 기본 유전 기능 (전사, 복제, 배상 등)의 조절에 또 다른 수준의 복잡성을 추가합니다. 크로마틴 폴딩은 주형 합성에 필요한 조절 트랜스 팩터 및 DNA 형태 변화 (이중 나선 풀기)에 대한 DNA의 접근성에 영향을 미칩니다. 따라서, 세포 핵에서의 DNA 의존성 합성 과정은 크로마틴의 응축되고 억압적인 상태로부터 보다 접근하기 쉽고, 개방된 형태로의 구조적 전이를 필요로 한다는 것이 일반적으로 받아들여진다. 세포학적으로, 이들 두 크로마틴 상태는 헤테로크로마틴 및 유크로마틴으로 정의된다. 그러나 핵에서 DNA 폴딩 방식에 관한 합의는 아직 이루어지지 않았다. 가설은 핵솜 섬유가 패킹 밀도가 상 분리 메커니즘에 의해 제어되는 임의의 중합체로서 행동하는 “중합체 용융” 모델(11)로부터, 두께12,13을 증가시키는 크로마틴 섬유형 구조의 순차적 형성을 가정하는 계층적 폴딩 모델에 이르기까지 다양하다. 계층적 폴딩 모델은 최근 계내 DNA-DNA 접촉(염색체 입체 형태 포획, 3C)의 분석에 기초한 분자 접근법으로부터 지지를 얻었으며, 이는 크로마틴 구조 도메인(14)의 계층 구조의 존재를 입증한다. 복제 단위는 이러한 크로마틴 도메인(15)과 매우 잘 상관관계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 이들 모델에 대한 주요 비판은 다양한 프로브 (예 : 항체)에 대한 크로마틴 접근성을 향상시키면서 초 구조 연구를 위해 크로마틴 대비를 개선하기 위해 세포막의 투과 및 비 염색질 성분의 제거와 같은 샘플 준비 절차에 의해 야기 된 잠재적 인 인공 염색질 응집에 기초합니다. DNA 결합 형광단에 의한 전자 현미경을 위한 선택적 DNA 염색의 최근 기술 발전은 디아미노벤지딘(ChromEMT6)의 광산화-매개 이러한 장애물의 제거를 허용하였다. 그러나, DNA17,18을 복제하는 전자 현미경 시각화에 대해서도 동일한 고려사항이 적용된다. 여기서 우리는 무손상 알데히드 가교 세포에서 새로 합성 된 DNA와 총 크로마틴의 동시 고해상도 초구조적 매핑을 가능하게하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 클릭 화학에 의한 EdU 표지 DNA의 검출을 비오티닐화 프로브 및 스트렙타비딘-나노골드 및 ChromEMT와 결합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 방법은 이전에 게시된 프로토콜에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 복제된 DNA를 표지하기 위한 클릭화학의 사용은 항체를 이용한 BrdU 검출을 위한 DNA 변성 전제조건의 필요성을 제거하여, 크로마틴 울트라구조를 더 잘 보존한다.
둘째, 글루타르알데히드 고정 및 결합되지 않은 알데히드 그룹의 적절한 담금질 후에 생성되는 보조 리간드로 비오틴의 활용?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 RSF (보조금 #17-15-01290) 및 RFBR (보조금 #19-015-00273)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자는 Lomonosov Moscow State University 개발 프로그램 (PNR 5.13)과 Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology의 상관 관계 이미징 분야의 Nikon Center of Excellence에 감사 드리며 이미징 계측에 대한 액세스를 제공합니다.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
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