Imágenes de dominios replicativos en cromatina ultraestructuralmente preservada por tomografía electrónica
Summary
Este protocolo presenta una técnica para el mapeo de alta resolución de sitios de replicación en cromatina estructuralmente preservada in situ que emplea una combinación de etiquetado EdU-streptavidin-Nanogold preincrustante y ChromEMT.
Abstract
Los principios del plegamiento del ADN en el núcleo celular y sus transformaciones dinámicas que ocurren durante el cumplimiento de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, segregación, etc.) siguen siendo poco conocidos, en parte debido a la falta de enfoques experimentales para la visualización de alta resolución de loci de cromatina específicos en núcleos estructuralmente conservados. Aquí presentamos un protocolo para la visualización de dominios replicativos en cultivo celular monocapa in situ, combinando el etiquetado EdU de ADN recién sintetizado con la posterior detección de etiquetas con amplificación ag-amplificación de partículas Nanogold y tinción ChromEM de cromatina. Este protocolo permite el etiquetado preincrustante de alto contraste y alta eficiencia, compatible con la fijación tradicional de glutaraldehído que proporciona la mejor preservación estructural de la cromatina para el procesamiento de muestras a temperatura ambiente. Otra ventaja del etiquetado de preincrustación es la posibilidad de preseleccionar celdas de interés para el seccionamiento. Esto es especialmente importante para el análisis de poblaciones celulares heterogéneas, así como la compatibilidad con los enfoques de tomografía electrónica para el análisis 3D de alta resolución de la organización de la cromatina en los sitios de replicación, y el análisis del reordenamiento de la cromatina post-replicativa y la segregación de cromátidas hermanas en la interfase.
Introduction
La replicación del ADN es un proceso biológico básico requerido para la copia fiel y la transmisión de la información genética durante la división celular. En eucariotas superiores, la replicación del ADN está sometida a una estrecha regulación espacio-temporal, que se manifiesta en la activación secuencial de los orígenes de replicación1. Los orígenes de replicación vecinos que se activan sincrónicamente forman grupos de replicons2. A nivel de microscopía óptica, los sitios de replicación continua del ADN se detectan como focos de replicación de varios números y tamaños. Los focos de replicación muestran patrones específicos de distribución espacial dentro del núcleo celular dependiendo del momento de replicación del ADN marcado 3,4, que, a su vez, está estrechamente correlacionado con su actividad genética. Gracias a una secuencia bien definida de replicación de ADN, estrictamente ordenada en el espacio y el tiempo, el etiquetado replicativo es un método poderoso de etiquetado preciso de ADN no solo para el estudio del proceso de replicación per se, sino también para discriminar una subfracción específica de ADN con actividad de transcripción definida y nivel de compactación. La visualización de la cromatina replicante se realiza generalmente a través de la detección de los principales componentes proteicos de la maquinaria de replicación del ADN (ya sea por inmunotinción o por expresión de etiquetas de proteínas fluorescentes 5,6) o mediante la incorporación de precursores de síntesis de ADN modificados 7,8,9,10 . De estos, solo los métodos basados en la incorporación de nucleótidos modificados en el ADN recién replicado permiten la captura de cambios conformacionales en la cromatina durante la replicación, y rastrean el comportamiento de los dominios replicativos después de que se completa su replicación.
En los eucariotas superiores, el empaquetamiento del ADN en cromatina agrega otro nivel de complejidad a la regulación de las funciones genéticas básicas (transcripción, replicación, reparación, etc.). El plegamiento de la cromatina afecta la accesibilidad del ADN a los factores trans reguladores y a los cambios conformacionales del ADN (desenrollamiento de doble hélice) necesarios para la síntesis de la plantilla. Por lo tanto, generalmente se acepta que los procesos sintéticos dependientes del ADN en el núcleo celular requieren una transición estructural de la cromatina de su estado condensado y represivo a una conformación más accesible y abierta. Citológicamente, estos dos estados de cromatina se definen como heterocromatina y eucromatina. Sin embargo, todavía no hay consenso sobre el modo de plegamiento del ADN en el núcleo. Las hipótesis van desde un modelo11 de “fusión polimérica”, donde la fibra nucleosómica se comporta como un polímero aleatorio para el cual la densidad de empaquetamiento está controlada por mecanismos de separación de fases, hasta modelos de plegamiento jerárquico que postulan la formación secuencial de estructuras similares a fibras de cromatina de espesor creciente12,13. Los modelos de plegamiento jerárquico recientemente obtuvieron apoyo de enfoques moleculares basados en el análisis de contactos ADN-ADN in situ (captura de conformación cromosómica, 3C), demostrando la existencia de la jerarquía de dominios estructurales de cromatina14. Es importante tener en cuenta que las unidades de replicación se correlacionan muy bien con estos dominios de cromatina15. La principal crítica de estos modelos se basa en la posible agregación artificial de cromatina causada por procedimientos de preparación de muestras, como la permeabilización de las membranas celulares y la eliminación de componentes que no son de cromatina, con el fin de mejorar el contraste de cromatina para estudios ultraestructurales al tiempo que mejora la accesibilidad de la cromatina para varias sondas (por ejemplo, anticuerpos). Los recientes avances técnicos en la tinción selectiva de ADN para microscopía electrónica mediante fotooxidación mediada por fluoróforos de unión al ADN de diaminobenzidina (ChromEMT6) han permitido la eliminación de este obstáculo. Sin embargo, las mismas consideraciones son válidas para la visualización de microscopía electrónica de la replicación del ADN17,18. Aquí describimos una técnica que permite el mapeo ultraestructural simultáneo de alta resolución del ADN recién sintetizado y la cromatina total en células intactas reticuladas por aldehído. La técnica combina la detección de ADN marcado con EdU por Click-chemistry con sondas biotiniladas y streptavidin-Nanogold, y ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito aquí tiene varias ventajas sobre los protocolos publicados anteriormente. En primer lugar, el uso de Click-chemistry para etiquetar el ADN replicado elimina la necesidad de un requisito previo de desnaturalización del ADN para la detección de BrdU con anticuerpos, preservando así mejor la ultraestructura de la cromatina.
En segundo lugar, la utilización de la biotina como ligando secundario que se genera después de la fijación del glutaraldehído y el enfriamiento a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por RSF (subvención #17-15-01290) y RFBR (subvención #19-015-00273). Los autores agradecen el programa de desarrollo de la Universidad Estatal lomonosov de Moscú (PNR 5.13) y el Centro de Excelencia Nikon en imágenes correlativas en el Instituto Belozersky de Biología Físico-Química por el acceso a la instrumentación de imágenes.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
