Imaging Replicative Domains i ultrastrukturellt bevarat kromatin genom elektrontomografi
Summary
Detta protokoll presenterar en teknik för högupplöst kartläggning av replikationsställen i strukturellt bevarat kromatin in situ som använder en kombination av förinbäddning av EdU-streptavidin-Nanogold-märkning och ChromEMT.
Abstract
Principer för DNA-vikning i cellkärnan och dess dynamiska omvandlingar som uppstår under uppfyllandet av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, segregering etc.) förblir dåligt förstådda, delvis på grund av bristen på experimentella metoder för högupplöst visualisering av specifika kromatinlokier i strukturellt bevarade kärnor. Här presenterar vi ett protokoll för visualisering av replikativa domäner i monolagercellodling in situ, genom att kombinera EdU-märkning av nyligen syntetiserat DNA med efterföljande etikettdetektion med Ag-amplifiering av Nanogold-partiklar och ChromEM-färgning av kromatin. Detta protokoll möjliggör högkontrast, högeffektiv förinbäddningsmärkning, kompatibel med traditionell glutaraldehydfixering som ger den bästa strukturella bevarandet av kromatin för rumstemperaturprovbehandling. En annan fördel med förinbäddning av märkning är möjligheten att förvälla celler av intresse för sektionering. Detta är särskilt viktigt för analys av heterogena cellpopulationer, liksom kompatibilitet med elektrontomografimetoder för högupplöst 3D-analys av kromatinorganisation vid replikationsställen och analys av postreplikativ kromatinomläggning och systerkromatidsegregering i interfasen.
Introduction
DNA-replikation är en grundläggande biologisk process som krävs för trogen kopiering och överföring av den genetiska informationen under celldelning. I högre eukaryoter utsätts DNA-replikation för tät spatio-temporal reglering, vilket manifesteras i sekventiell aktivering av replikationens ursprung1. Angränsande replikeringsursprung som avfyras synkront bildar kluster av replikationskoner2. På nivån av optisk mikroskopi detekteras platser för pågående DNA-replikation som replikationsfoci av olika antal och storlek. Replikationsfoci visar specifika mönster för rumslig fördelning inom cellkärnan beroende på replikationstiden för det märkta DNA 3,4, vilket i sin tur är tätt korrelerat med dess genaktivitet. Tack vare väldefinierad sekvens av DNA-replikation, strikt ordnad i rum och tid, är replikativ märkning en kraftfull metod för exakt DNA-märkning, inte bara för studier av replikationsprocessen i sig, utan också för att diskriminera en specifik DNA-subfraktion med definierad transkriptionsaktivitet och komprimeringsnivå. Visualisering av replikerande kromatin utförs vanligtvis genom detektion av huvudproteinkomponenter i DNA-replikationsmaskiner (antingen genom immunfärgning eller genom uttryck av fluorescerande proteintaggar 5,6) eller genom införlivande av modifierade DNA-syntesprekursorer 7,8,9,10 . Av dessa möjliggör endast metoder baserade på införlivandet av modifierade nukleotider i nyligen replikerat DNA att fånga konformationsförändringar i kromatin under replikation och spåra beteendet hos replikativa domäner efter att deras replikation är klar.
I högre eukaryoter lägger DNA-förpackning i kromatin till en annan nivå av komplexitet till regleringen av grundläggande genetiska funktioner (transkription, replikation, reparation etc.). Kromatinveckning påverkar DNA: s tillgänglighet till regulatoriska transfaktorer och DNA-konformationsförändringar (dubbelhelixavlindning) som krävs för mallsyntesen. Därför är det allmänt accepterat att DNA-beroende syntetiska processer i cellkärnan kräver en strukturell övergång av kromatin från dess kondenserade, repressiva tillstånd till en mer tillgänglig, öppen konformation. Cytologiskt definieras dessa två kromatintillstånd som heterokromatin och eukromatin. Det finns emellertid fortfarande ingen enighet om sättet att DNA-vikas i kärnan. Hypoteserna sträcker sig från en “polymersmältningsmodell” 11, där nukleosomal fiber beter sig som en slumpmässig polymer för vilken förpackningsdensiteten styrs av fasseparationsmekanismer, till hierarkiska vikningsmodeller som postulerar sekventiell bildning av kromatinfiberliknande strukturer med ökande tjocklek12,13. Hierarkiska vikningsmodeller fick nyligen stöd från molekylära tillvägagångssätt baserade på analys av in situ DNA-DNA-kontakter (kromosomkonformationsfångst, 3C), vilket visar förekomsten av hierarkin för kromatinstrukturella domäner14. Det är viktigt att notera att replikationsenheter korrelerar mycket bra med dessa kromatindomäner15. Den största kritiken mot dessa modeller är baserad på potentiell artificiell kromatinaggregering orsakad av provberedningsförfaranden, såsom permeabilisering av cellmembran och avlägsnande av icke-kromatinkomponenter, för att förbättra kromatinkontrasten för ultrastrukturella studier samtidigt som kromatintillgängligheten för olika sonder förbättras (t.ex. antikroppar). De senaste tekniska framstegen inom selektiv DNA-färgning för elektronmikroskopi genom DNA-bindande fluoroformedierad fotooxidation av diaminobenzidin (ChromEMT6) har gjort det möjligt att eliminera detta hinder. Samma överväganden gäller emellertid för elektronmikroskopivisualisering av replikering av DNA17,18. Här beskriver vi en teknik som möjliggör samtidig högupplöst ultrastrukturell kartläggning av nysyntetiserat DNA och totalt kromatin i intakta aldehyd-tvärbundna celler. Tekniken kombinerar detektion av EdU-märkt DNA genom klickkemi med biotinylerade sonder och streptavidin-nanoguld och ChromEMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs här har flera fördelar jämfört med tidigare publicerade protokoll. För det första eliminerar användningen av klickkemi för märkning av replikerat DNA nödvändigheten av DNA-denatureringsförutsättningsförutsättning för BrdU-detektion med antikroppar, vilket bättre bevarar kromatin ultrastruktur.
För det andra minimerar användningen av biotin som en sekundär ligand som genereras efter glutaraldehydfixering och korrekt släckning av obundna aldehydgrupper …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av RSF (bidrag #17-15-01290) och RFBR (bidrag #19-015-00273). Författarna tackar Lomonosov Moscow State University utvecklingsprogram (PNR 5.13) och Nikon Center of Excellence i korrelativ avbildning vid Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology för tillgång till bildinstrumentering.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
