Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları
Summary
Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT’nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.
Abstract
Hücre çekirdeğinde DNA katlanmasının prensipleri ve temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, ayrışma vb.) yerine getirilmesi sırasında meydana gelen dinamik dönüşümleri, kısmen yapısal olarak korunmuş çekirdeklerde spesifik kromatin lokuslarının yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesine yönelik deneysel yaklaşımların bulunmaması nedeniyle tam olarak anlaşılamamıştır. Burada, yeni sentezlenen DNA’nın EdU etiketlemesini, daha sonra Nanogold parçacıklarının Ag-amplifikasyonu ve kromatinin ChromEM boyaması ile sonraki etiket tespiti ile birleştirerek, tek katmanlı hücre kültüründe replikatif alanların in situ olarak görselleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, oda sıcaklığında numune işleme için kromatinin en iyi yapısal korumasını sağlayan geleneksel glutaraldehit fiksasyonu ile uyumlu, yüksek kontrastlı, yüksek verimli ön gömme etiketlemesine izin verir. Önceden gömme etiketlemenin bir diğer avantajı, bölümleme için ilgilenilen hücreleri önceden seçme olasılığıdır. Bu, özellikle heterojen hücre popülasyonlarının analizinin yanı sıra, replikasyon bölgelerinde kromatin organizasyonunun yüksek çözünürlüklü 3D analizine elektron tomografisi yaklaşımlarıyla uyumluluk ve replikatif sonrası kromatin yeniden düzenlenmesi ve ara fazda kardeş kromatid ayrışmasının analizi için önemlidir.
Introduction
DNA replikasyonu, hücre bölünmesi sırasında genetik bilginin sadık bir şekilde kopyalanması ve iletilmesi için gerekli olan temel bir biyolojik süreçtir. Daha yüksek ökaryotlarda, DNA replikasyonu, replikasyon kökenlerinin sıralı aktivasyonunda kendini gösteren sıkı uzaysal-zamansal düzenlemeye tabi tutulur1. Eşzamanlı olarak ateşlenen komşu çoğaltma kaynakları, replikon2 kümeleri oluşturur. Optik mikroskopi düzeyinde, devam eden DNA replikasyon bölgeleri, çeşitli sayı ve büyüklükte replikasyon odakları olarak tespit edilir. Replikasyon odakları, etiketli DNA 3,4’ün replikasyon zamanlamasına bağlı olarak hücre çekirdeği içindeki belirli uzamsal dağılım kalıplarını gösterir ve bu da gen aktivitesi ile sıkı bir şekilde ilişkilidir. Uzay ve zamanda kesin olarak sıralanmış iyi tanımlanmış DNA replikasyon dizisi sayesinde, replikatif etiketleme, sadece replikasyon sürecinin kendi başına incelenmesi için değil, aynı zamanda tanımlanmış transkripsiyon aktivitesi ve sıkıştırma seviyesi ile spesifik bir DNA alt fraksiyonunu ayırt etmek için de güçlü bir hassas DNA etiketleme yöntemidir. Replikasyon kromatininin görselleştirilmesi genellikle DNA replikasyon makinesinin ana protein bileşenlerinin tespiti yoluyla (immünoboyama veya floresan protein etiketlerinin ekspresyonu 5,6) veya modifiye DNA sentezi öncüllerinin dahil edilmesi yoluyla gerçekleştirilir 7,8,9,10 . Bunlardan sadece modifiye nükleotidlerin yeni kopyalanmış DNA’ya dahil edilmesine dayanan yöntemler, replikasyon sırasında kromatindeki konformasyonel değişikliklerin yakalanmasına izin verir ve replikasyonları tamamlandıktan sonra replikatif alanların davranışını izler.
Daha yüksek ökaryotlarda, kromatine DNA paketlemesi, temel genetik fonksiyonların (transkripsiyon, replikasyon, onarım vb.) düzenlenmesine başka bir karmaşıklık seviyesi ekler. Kromatin katlaması, DNA’nın düzenleyici trans-faktörlere ve şablon sentezi için gerekli DNA konformasyonel değişikliklerine (çift sarmal çözme) erişilebilirliğini etkiler. Bu nedenle, hücre çekirdeğindeki DNA’ya bağımlı sentetik süreçlerin, kromatinin yoğunlaşmış, baskıcı durumundan daha erişilebilir, açık bir konformasyona yapısal bir geçişini gerektirdiği genel olarak kabul edilmektedir. Sitolojik olarak, bu iki kromatin durumu heterokromatin ve ökromatin olarak tanımlanır. Bununla birlikte, çekirdekte DNA’nın katlanma şekli konusunda hala bir fikir birliği yoktur. Hipotezler, nükleozomal elyafın, ambalaj yoğunluğunun faz ayırma mekanizmaları tarafından kontrol edildiği rastgele bir polimer gibi davrandığı bir “polimer eriyik” model11’den, artan kalınlıkta kromatin lifi benzeri yapıların sıralı oluşumunu varsayan hiyerarşik katlanma modellerine kadar uzanmaktadır12,13. Hiyerarşik katlama modelleri son zamanlarda in situ DNA-DNA temaslarının (kromozom konformasyon yakalama, 3C) analizine dayanan moleküler yaklaşımlardan destek alarak, kromatin yapısal alanlarının hiyerarşisinin varlığını göstermiştir14. Replikasyon birimlerinin bu kromatin alanları15 ile çok iyi ilişkili olduğunu belirtmek önemlidir. Bu modellerin başlıca eleştirisi, çeşitli problar (örneğin, antikorlar) için kromatin erişilebilirliğini artırırken, ultrayapısal çalışmalar için kromatin kontrastını iyileştirmek amacıyla, hücre zarlarının geçirgenleştirilmesi ve kromatin olmayan bileşenlerin çıkarılması gibi numune hazırlama prosedürlerinin neden olduğu potansiyel yapay kromatin agregasyonuna dayanmaktadır. Diaminobenzidinin (ChromEMT6) DNA bağlayıcı florofor aracılı foto-oksidasyonu ile elektron mikroskobu için seçici DNA boyamadaki son teknik gelişmeler, bu engelin ortadan kaldırılmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, aynı hususlar, DNA 17,18’i kopyalayan elektron mikroskobu görselleştirmesi için de geçerlidir. Burada, bozulmamış aldehit çapraz bağlı hücrelerde yeni sentezlenen DNA ve toplam kromatinin eşzamanlı yüksek çözünürlüklü ultrastrüktürel haritalanmasına izin veren bir tekniği açıklıyoruz. Teknik, EdU etiketli DNA’nın Click-kimyası ile biyotinile problar ve streptavidin-Nanogold ve ChromEMT ile tespitini birleştirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yöntemin daha önce yayımlanmış protokollere göre birçok avantajı vardır. İlk olarak, replika DNA’yı etiketlemek için Click-kimyasının kullanılması, antikorlarla BrdU tespiti için DNA denatürasyon ön koşulunun gerekliliğini ortadan kaldırır, böylece kromatin ultrayapısını daha iyi korur.
İkincisi, glutaraldehit fiksasyonundan sonra üretilen ikincil bir ligand olarak biyotinin kullanılması ve bağlanmamış aldehit gruplarının uygun şekilde s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen RSF (hibe #17-15-01290) ve RFBR (hibe #19-015-00273) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, görüntüleme enstrümantasyonuna erişim için Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü’nde Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi geliştirme programına (PNR 5.13) ve Nikon Mükemmeliyet Merkezi’ne korelasyon görüntülemede teşekkür ediyor.
Materials
| Reagent | |||
| 5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU) | Thermo Fisher | A10044 | |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | |
| AlexaFluor 555-azide | Termo Fisher | A20012 | |
| biotin-azide | Lumiprobe | C3730 | |
| Bovine Serum Albumine | Boval | LY-0080 | |
| DDSA | SPI-CHEM | 26544-38-7 | |
| DMP-30 | SPI-CHEM | 90-72-2 | |
| DRAQ5 | Thermo Scientific | 62251 | |
| Epoxy resin monomer | SPI-CHEM | 90529-77-4 | |
| Glutaraldehyde (25%, EM Grade) | TED PELLA, INC | 18426 | |
| Gum arabic | ACROS Organics | 258850010 | |
| Magnesium chloride | Panreac | 141396.1209 | |
| NaBH4 | SIGMA-ALDRICH | 213462 | |
| NMA | SPI-CHEM | 25134-21-8 | |
| N-propyl gallate | SIGMA-ALDRICH | P3130 | |
| PBS | MP Biomedicals | 2810305 | |
| Silver lactate | ALDRICH | 359750-5G | |
| Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugate | Termo Fisher | S11223 | |
| Streptavidin-Nanogold conjugate | Nanoprobes | 2016 | |
| tetrachloroauric acid | SIGMA-ALDRICH | HT1004 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | CHEM-IMPEX INT'L | 298 | |
| Triton X-100 | Fluka Chemica | 93420 | |
| Instruments | |||
| Carbon Coater | Hitachi | ||
| Copper single slot grids | Ted Pella | 1GC10H | |
| Cy5 fluorescence filter set (Ex620/60 DM660 Em700/75) | Nikon | Cy5 HQ | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| Diamond knife Ultra Wet 45o | Diatome | DU | Alternatives: Ted Pella |
| Fluorescent microscope | Nikon | Ti-E | Alternatives: Zeiss, Leica, Olympus |
| High-tilt sample holder | Jeol | ||
| Rotator | Biosan | Multi Bio RS-24 | |
| Transmission electron microscope operating at 200 kV in EFTEM mode, with high-tilt goniometer | Jeol | JEM-2100 | Alternatives: FEI, Hitachi |
| Tweezers | Ted Pella | 523 | |
| Ultramicrotome | Leica | UltraCut-E | Alternatives: RMC |
| Software | |||
| Image acquisition | Open Source | SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/) | |
| Image processing | Open Source | IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/) |
Referências
- Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
- Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
- Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737 (2010).
- Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
- Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
- Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
- Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
- Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
- Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
- Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
- Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
- Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
- Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
- Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
- Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O’Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
- Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
- Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
- Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
- Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
- He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
- Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).
