测量来自母猪后代的先前冷冻心脏组织中的线粒体电子转移复合物：评估运动诱导的线粒体生物能量变化的模型
Summary
从先前冷冻的存档固体组织中制备富含线粒体的样品，使研究人员能够以各种实验方式对线粒体进行功能和分析评估。这项研究展示了如何从冷冻的心脏组织制备富含线粒体的制剂，并对线粒体进行分析评估。
Abstract
线粒体电子转移复合物（ETC）谱在运动母猪所生后代的心脏组织中被修改。提出并测试的假设是，在怀孕期间母猪的定期母体运动将增加后代心脏生物能量的线粒体效率。通过使用轻度分离程序分离线粒体来评估线粒体ETC和超复合物谱，以测试该假设。这里描述的程序允许处理先前冷冻的存档心脏组织，并消除了新鲜线粒体制备评估线粒体ETC复合物，超复合物和ETC复合物活性谱的必要性。该协议描述了使用蓝天然凝胶电泳进行基于多重抗体的免疫印迹和超复杂评估中的最佳ETC蛋白复合物测量。
Introduction
该协议的目标是提供详细的步骤，通过一种低能机械破坏组织的新技术从先前冷冻的心脏组织中获得富含线粒体的制剂，从而改善组织裂解和线粒体的提取。通过这种方法，可以在不产生高剪切应力或高温的情况下提高提取效率，并且均质时间短（10-12秒）可实现1。
从存档的冷冻组织中获得线粒体是进行功能2 和生化研究3的宝贵资产， 否则在确切的实验条件下不容易重复。经典的Potter-Elvehjem特氟龙杵玻璃均质机或Dounce均质机已被使用，并且仍在研究实验室中使用，以均质化肝脏，肾脏和大脑等软组织。然而，肌肉和心脏等硬组织均质化需要更多的均质时间，酶处理，高速均质和丰富的用户体验。这对于从肌肉和心脏等硬组织中提取完整的细胞器（如线粒体）是不利的。该方案中描述的方法用于获得高产量的富含线粒体的制剂，以分析线粒体电子传递链（ETC）蛋白质复合物及其在从运动和久坐不动的母猪出生的后代收获的心脏组织中的超复合物形成，在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C以备将来使用。该方法允许用户从先前冷冻的存档组织中分离出富含线粒体的制剂。
外界纳米材料暴露于妊娠期啮齿动物会对后代的心脏功能、线粒体呼吸和生物能量产生负面影响4。然而，有氧运动诱导的妊娠期胎儿肌细胞生物能量的积极变化尚未得到证实。然而，新兴研究提供证据表明，孕产妇在怀孕期间进行有氧运动对胎儿心脏功能有积极影响5。为了提供进一步的证据，分析了妊娠期间母体运动对后代心脏线粒体呼吸链复合物（即复合物I至复合物V）的纵向影响。
这项研究具有重要的健康相关性，因为结果可能表明母亲的运动可以提高后代心脏线粒体的能量产生效率。在这项研究中，母猪（母猪）被用作动物模型有两个原因：（i）心脏生理学与人类相似6，以及（ii）根据机构IACUC批准，从不同时间点的后代收获心脏组织是可行的。拟议的研究旨在回答许多基本问题，这些问题与母亲的运动及其对后代心脏组织的细胞和生化组成的潜在积极影响有关。这种方法需要温和而有效的线粒体分离技术，这些技术来自先前冷冻的心脏组织，这些研究来自冗长且昂贵的纵向研究，这些研究解决了怀孕期间胎儿心肌细胞内生物能量变化的问题。本研究中描述的方法允许利用大量先前冷冻的存档组织进行富含线粒体的制备，以进行分析和功能研究。该研究还将通过提供初步数据来帮助填补该领域的知识空白，这可能导致未来的研究确定孕产妇运动对子宫内外心脏健康的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处指明了此协议的关键步骤。首先，应仔细处理组织均质化，以便在组织均质过程中不会施加过多的纯粹效应。应使用组织粉碎机，这是用于初始组织均质的压力循环技术（PCT）的一部分9。该步骤将减少玻璃对玻璃均质机的过度中风周期（图1B），由于冷冻组织条件，可能会进一步破坏已经脆弱的线粒体。其次，冷冻组织重量对于获得足够量的富含线粒?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了堪萨斯城大学对Abdulbaki Agbas的校内资助和Daniel Barrera的暑期研究奖学金的财政支持。作者感谢Jan Talley博士的编辑工作。
Materials
| Amino caproic acid | Sigma/Aldrich | A2504-100G | |
| Anti-Hu Total OxPhos complex kit | Invitrogen | 458199 | |
| anti-VDAC antibody | abcam | ab15895 | use 1 µg/mL |
| Coomassie G-250 | ThermoSientific | 20279 | |
| Coomassie GelCode Blue | ThermoScientific | 24592 | |
| Digitonin | Cabiochem | 300410 | |
| Glass-Glass pestle homogenizer | VWR | KT885451-0020 | |
| Image Studio | LICOR | ||
| IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab | LICOR | LC0725 | |
| Multiwell plate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Native molecular weight marker | ThermoFisher | BN2001 | |
| Nylon mesh monofilament | Small Part Inc | CMN-74 | |
| Orbital shaker | ThermoScientfic | ||
| PCT Shredder | Pressure Bioscience Inc | ||
| SEA BLOCK Blocking buffer | ThermoScienctific | 37527 | |
| Shredder PULSE Tube | Pressure Bioscience Inc | FT500-PS | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Trypsin | Amresco | M150-1G | |
| Trypsin inhibitor | Amresco | M191-1G | Requires fresh preparation |
Referências
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