Medindo complexos de transferência de elétrons mitocondrial em tecido cardíaco previamente congelado da prole da porca: um modelo para avaliar alterações bioenergetics mitocondrial induzidas pelo exercício

Summary

A preparação de amostras enriquecidas com mitocôndrias de tecidos sólidos arquivados previamente congelados permitiu que os pesquisadores realizassem avaliações funcionais e analíticas de mitocôndrias em várias modalidades experimentais. Este estudo demonstra como preparar preparações enriquecidas com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco congelado e realizar avaliações analíticas de mitocôndrias.

Abstract

O perfil do complexo de transferência de elétrons mitocondrial (ETC) é modificado no tecido cardíaco da prole nascido em uma porca exercida. A hipótese proposta e testada foi que um exercício materno regular de uma porca durante a gravidez aumentaria a eficiência mitocondrial da bioenergetic do coração da prole. Essa hipótese foi testada por mitocôndrias isolando utilizando um procedimento de isolamento leve para avaliar perfis mitocondriais etc e supercomplexo. O procedimento aqui descrito permitiu o processamento de tecidos cardíacos arquivados previamente congelados e eliminou a necessidade de preparação de mitocôndrias frescas para a avaliação de complexos etc mitocondrial, supercomplexos e perfis de atividades complexas etc. Este protocolo descreve a medição ideal do complexo proteico ETC em imunoblotting baseado em anticorpos multiplexados e avaliação super complexa usando eletroforese de gel azul-nativa.

Introduction

O objetivo deste protocolo foi fornecer passos detalhados para obter a preparação enriquecida com mitocôndrias a partir de tecido cardíaco previamente congelado com uma nova tecnologia de interrupção mecânica de baixa energia do tecido que melhora a lise tecidual e a extração de mitocôndrias. Com este método, a melhoria da eficiência extração sem gerar alto estresse de tesoura ou alta temperatura e curto tempo de homogeneização (10-12 s) tornam-se ^{alcançáveis1}.

Obter mitocôndrias a partir de tecido congelado arquivado é um ativo valioso para realizar estudos ^funcionais2 e bioquímicos3

Protocol

Os tecidos cardíacos da prole congelada foram recebidos do Dr. Sean Newcomer juntamente com a carta de aprovação institucional da IACUC. Os tecidos cardíacos foram obtidos a partir de um estudo longitudinal de longo prazo, congelados em nitrogênio líquido, e armazenados a -80 °C para uso futuro. Todos os protocolos relativos ao processamento de tecido cardíaco da prole seguiram as diretrizes dos comitês da Universidade de Kansas City IBC e da IACUC.

1. Preparação de tampões e reagentes

NOTA: Prepare todas as amostras de acordo com as diretrizes do fabricante. Use água ultra-purificada ou equivalente em todas as rec....

Results

Seguindo o protocolo, foi preparado um bom rendimento da mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias a partir do tecido cardíaco. Aproximadamente 15 mg/mL de mistura de proteína enriquecida com mitocôndrias foram obtidos a partir de uma média de 1,2 g de tecido cardíaco congelado colhido da prole da porca. Observações indicaram que menos de 0,5 g de tecido cardíaco congelado não produziu uma quantidade suficiente de mistura de proteína enriquecida mitocondrial para realizar um ensaio BN-PAGE. A quantidade de prepara.......

Discussion

Os passos críticos para este protocolo estão indicados aqui. Em primeiro lugar, a homogeneização do tecido deve ser cuidadosamente tratada para que efeitos excessivos não sejam aplicados durante o processo de homogeneização do tecido. Deve-se utilizar um triturador de tecidos, que faz parte da tecnologia de ciclismo de pressão (PCT) para homogeneização inicial do ^tecido9. Esta etapa reduzirá o ciclo excessivo de avc do homogeneizador de vidro em vidro (Figura 1B) que .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino ácido capróico	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit	Invitrogen	458199
anti-VDAC anticorpo	abcam	ab15895	use 1 µ g / mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonin	Cabiochem	300410
Homogeneizador de pilão de vidro	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Dye conjugado anti-coelho Ab	LICOR	LC0725
Leitor de placas multipoços	BioTek	Synergy HT
Marcador de peso molecular nativo	ThermoFisher	BN2001
Monofilamento de malha de nylon	Small Part Inc	CMN-74
Agitador orbital	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Buffer de bloqueio	ThermoScienctific	37527
Triturador PULSE	Tube Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Centrífuga de mesa	Eppendorf	5418
Tripsina	Amresco	M150-1G
Inibidor de tripsina	Amresco	M191-1G	Requer nova preparação