Echtzeit-Fluoreszenzmessung synaptischer Funktionen in Modellen der amyotrophen Lateralsklerose

Summary

Es werden zwei verwandte Methoden beschrieben, um subzelluläre Ereignisse zu visualisieren, die für die synaptische Übertragung erforderlich sind. Diese Protokolle ermöglichen die Echtzeitüberwachung der Dynamik des präsynaptischen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelmembranfusion mittels Lebendzellbildgebung von in vitro kultivierten Neuronen.

Abstract

Vor der neuronalen Degeneration ist die Ursache für motorische und kognitive Defizite bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose (ALS) und/oder Frontotemporallappendemenz (FTLD) eine Dysfunktion der Kommunikation zwischen Neuronen und Motoneuronen und Muskeln. Der zugrunde liegende Prozess der synaptischen Übertragung beinhaltet die membrandepolarisationsabhängige synaptische Vesikelfusion und die Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse. Dieser Prozess geschieht durch lokalisierten Kalziumeinstrom in die präsynaptischen Terminals, in denen sich synaptische Vesikel befinden. Hier beschreibt das Protokoll fluoreszenzbasierte Live-Imaging-Methoden, die zuverlässig depolarisationsvermittelte synaptische Vesikelexozytose und präsynaptische terminale Kalziumeinflussdynamik in kultivierten Neuronen melden.

Mit einem Styrylfarbstoff, der in synaptische Vesikelmembranen eingearbeitet wird, wird die synaptische Vesikelfreisetzung aufgeklärt. Auf der anderen Seite, um den Eintritt von Kalzium zu untersuchen, wird Gcamp6m verwendet, ein genetisch kodierter fluoreszierender Reporter. Wir verwenden eine hohe Kaliumchlorid-vermittelte Depolarisation, um die neuronale Aktivität nachzuahmen. Um die synaptische Vesikelexozytose eindeutig zu quantifizieren, messen wir den Verlust der normalisierten Styrylfarbstofffluoreszenz als Funktion der Zeit. Unter ähnlichen Stimulationsbedingungen, im Falle eines Kalziumeinflusses, nimmt die Gcamp6m-Fluoreszenz zu. Die Normalisierung und Quantifizierung dieser Fluoreszenzänderung erfolgt ähnlich wie das Styrylfarbstoffprotokoll. Diese Methoden können mit transfektionsbasierter Überexpression fluoreszenzmarkierter mutierter Proteine gemultiplext werden. Diese Protokolle wurden ausgiebig verwendet, um synaptische Dysfunktion in Modellen von FUS-ALS und C9ORF72-ALS unter Verwendung von primären kortikalen und motorischen Neuronen von Nagetieren zu untersuchen. Diese Protokolle ermöglichen ein schnelles Screening von Verbindungen, die die neuronale Kommunikation verbessern können. Daher sind diese Methoden nicht nur für das Studium von ALS, sondern für alle Bereiche der neurodegenerativen und entwicklungsneurowissenschaftlichen Forschung wertvoll.

Introduction

Die Modellierung der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) im Labor ist aufgrund der überwiegend sporadischen Natur von über 80 % der ^Fälle1 in Verbindung mit der großen Anzahl genetischer Mutationen, von denen bekannt ist, dass sie krankheitserregend ^{sind2, eine einzigartige Herausforderung2}. Trotzdem haben alle Fälle von ALS das verbindende Merkmal gemeinsam, dass es vor der vollständigen neuronalen Degeneration zu einer dysfunktionalen Kommunikation zwischen präsynaptischen Motoneuronen und postsynaptischen Muskelzellen ^kommt3,4. Klinisch, wenn Patienten die Konnektivität der verbleibenden oberen und unteren Motoneuronen verlieren, weisen sie während der gesamten Krankheit Merkmale der neuronalen Hyper- und Hypoerregbarkeit auf5,6,7,8,9^, die komplexe zugrunde liegende molekulare Veränderungen dieser Synapsen widerspiegeln^, die wir als ALS-Forscher zu verstehen versuchen.

Mehrere transgene Modelle haben gezeigt, dass Verschlechterung und Desorganisation der neuromuskulären Verbindung mit der Expression von ALS-verursachenden genetischen Mutationen auftreten, einschließlich SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 und TDP4317,18,19 durch morphologische Bewertungen, einschließlich der Bewertung von synaptischen Boutons, Wirbelsäulendichten und prä- / postsynaptischer Organisation. Mechanistisch war es seit den bahnbrechenden Arbeiten von Cole, Hodgkin und Huxley in den 1930er Jahren auch möglich, synaptische Reaktionen durch elektrophysiologische Techniken entweder in vitro-Zellkultur oder in Gewebeschnittpräparaten zu ^bewerten20. Durch diese Strategien haben viele ALS-Modelle synaptische Übertragungsdefizite gezeigt. Zum Beispiel verursacht eine mutierte Variante von TDP43 eine erhöhte Feuerfrequenz und verringert die Aktionspotentialschwelle in NSC-34 (Rückenmark x Neuroblastom Hybridzelllinie 34) motorisch-neuronenähnlichen ^Zellen21. Dieselbe Variante verursacht auch eine dysfunktionale synaptische Übertragung an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) vor dem Auftreten von verhaltensbedingten motorischen Defiziten in einem ^Mausmodell22. Es wurde zuvor gezeigt, dass die mutierte FUS-Expression in einem Drosophila-Modell von FUS-ALS vor lokomotorischen Defekten zu einer reduzierten synaptischen Übertragung am NMJ ^führt11. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht unter Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen, die aus C9orf72-Expansionsträgern gewonnen wurden, zeigte eine Verringerung des leicht freisetzbaren Pools synaptischer ^Vesikel23. Insgesamt unterstreichen diese und andere Studien, wie wichtig es ist, ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen aufzubauen, die der synaptischen Signalübertragung in krankheitsrelevanten Modellen der ALS zugrunde liegen. Dies wird entscheidend sein, um die Pathobiologie von ALS zu verstehen und potenzielle therapeutische Ziele für Patienten zu entwickeln.

Methoden der Strom- und Spannungsspannzellen waren von unschätzbarem Wert bei der Bestimmung von Membraneigenschaften wie Leitwert, Ruhemembranpotential und Quantengehalt einzelner ^{Synapsen20,24}. Eine der wesentlichen Einschränkungen der Elektrophysiologie besteht jedoch darin, dass sie technisch anspruchsvoll ist und nur Erkenntnisse von einem einzelnen Neuron gleichzeitig liefert. Die konfokale Lebendzellmikroskopie, gekoppelt mit spezifischen fluoreszierenden Sonden, bietet die Möglichkeit, die synaptische Übertragung von Neuronen räumlich-zeitlich zu untersuchen25,26,27. Obwohl dieser Fluoreszenzansatz kein direktes Maß für die neuronale Erregbarkeit ist, kann er eine relative Messung von zwei molekularen Korrelationen der synaptischen Funktion liefern: synaptische Vesikelfreisetzung und Calciumtransienten an synaptischen Terminals.

Wenn ein Aktionspotential die präsynaptische terminale Region von Neuronen erreicht, werden Calciumtransienten ausgelöst, was den Übergang von einem elektrischen Signal zum Prozess der Neurotransmitterfreisetzung ^{erleichtert28.} Spannungsgesteuerte Kalziumkanäle, die in diesen Bereichen lokalisiert sind, regulieren die Kalziumsignalisierung streng, um die Kinetik der Neurotransmitterfreisetzung zu ^{modulieren29.} Die ersten berichteten fluoreszenzbasierten Aufzeichnungen von Calciumtransienten wurden entweder mit dem Zweiwellenlängenindikator Fura-2 AM oder dem Einzelwellenlängenfarbstoff Fluo-3 AM30,31,32 durchgeführt. Während diese Farbstoffe zu dieser Zeit großartige neue Erkenntnisse boten, leiden sie unter mehreren Einschränkungen wie unspezifischer Kompartimentierung innerhalb von Zellen, aktivem oder passivem Farbstoffverlust aus markierten Zellen, Photobleichen und Toxizität, wenn sie über längere Zeiträume abgebildet ^werden33. In den letzten zehn Jahren sind genetisch kodierte Kalziumindikatoren zu den Arbeitspferden für die Abbildung verschiedener Formen neuronaler Aktivität geworden. Diese Indikatoren kombinieren ein modifiziertes fluoreszierendes Protein mit einem Calciumchelatorprotein, das nach der Bindung von ^Ca2+-Ionen schnell die Fluoreszenzintensität ^wechselt34. Die Anwendung dieser neuen Indikatoren ist enorm und ermöglicht eine viel einfachere Visualisierung intrazellulärer Calciumtransienten sowohl in vitro- als auch de vivo-Umgebungen. Eine Familie dieser genetisch kodierten Reporter, bekannt als GCaMP, wird jetzt breit genutzt. Diese Indikatoren enthalten eine C-terminale Calmodulindomäne, gefolgt von grün fluoreszierendem Protein (GFP), und sind durch eine N-terminale Calmodulin-Bindungsregion ^{begrenzt35,36.} Die Calciumbindung an die Calmodulindomäne löst eine Wechselwirkung mit der Calmodulin-bindenden Region aus, was zu einer Konformationsänderung der gesamten Proteinstruktur und einer erheblichen Erhöhung der Fluoreszenz der GFP-Einheit ^führt35,36. Im Laufe der Jahre hat diese Reporterfamilie mehrere Entwicklungen durchlaufen, um unterschiedliche Auslesungen für bestimmte Kalziumtransienten mit spezifischer Kinetik (langsam, mittel und schnell) mit jeweils leicht unterschiedlichen Eigenschaften zu ^{ermöglichen37,38.} Hier wurde die Verwendung des Reporters GcaMP6 hervorgehoben, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er einzelne Aktionspotentiale und dendritische Calciumtransienten in Neuronen sowohl in vivo als auch in vitro ^nachweist37.

Calciumtransienten in der präsynaptischen Region lösen synaptische Vesikelfusionsereignisse aus, die eine Freisetzung von Neurotransmittern in die Synapse und die Initiierung von Signalereignissen in der postsynaptischen ^{Zelle verursachen28,39.} Synaptische Vesikel werden sowohl schnell freigesetzt als auch recycelt, da die Zelle homöostatisch eine stabile Zellmembranoberfläche und einen leicht lösbaren Pool fusionsfähiger membrangebundener Vesikel ^{beibehält40.} Der hier verwendete Styrylfarbstoff hat eine Affinität zu Lipidmembranen und verändert seine Emissionseigenschaften spezifisch anhand der Ordnung der umgebenden ^{Lipidumgebung41,42}. Somit ist es ein ideales Werkzeug für die Markierung von synaptischen Recyclingvesikeln und die anschließende Verfolgung dieser Vesikel, da sie später nach neuronaler Stimulation freigesetzt ^werden41,42. Das Protokoll, das generiert und optimiert wurde, ist eine Adaption der ursprünglich von Gaffield und Kollegen beschriebenen Konzepte, die es uns ermöglicht, styrylfarbstoffmarkierte synaptische Vesikelpunkta im Laufe der Zeit kontinuierlich zu ^{visualisieren41.}

Hier werden zwei verwandte fluoreszenzbasierte Methoden beschrieben, die zuverlässig über spezifische zelluläre Ereignisse berichten, die an der synaptischen Übertragung beteiligt sind. Protokolle wurden definiert, um die Dynamik des depolarisationsvermittelten präsynaptischen terminalen Kalziumeinflusses und der synaptischen Vesikelexozytose in kultivierten Neuronen zu untersuchen. Hier konzentrieren sich Methoden und repräsentative Ergebnisse auf die Verwendung primärer kortikaler oder motorischer Neuronen von Nagetieren als In-vitro-Modellsystem, da es veröffentlichte Studien mit diesen Zelltypen ^gibt43,44. Diese Methoden sind jedoch auch auf differenzierte humane i3-kortikal-ähnliche Neuronen ^anwendbar45, da wir auch mit beiden Protokollen in derzeit laufenden Experimenten in unserem Labor erfolgreich waren. Das allgemeine Protokoll ist in einem schrittweisen linearen Format dargestellt (siehe Abbildung 1). Kurz gesagt, um die Kalziumdynamik in Neuriten zu untersuchen, werden reife Neuronen mit Plasmid-DNA transfiziert, um den fluoreszierenden Reporter GCaMP6m unter einem Cytomegalovirus (CMV) -Promotor zu ^{exprimieren37,46.} Transfizierte Zellen haben eine geringe basale grüne Fluoreszenz, die in Gegenwart von Kalzium zunimmt. Interessante Regionen werden angegeben, um Fluoreszenzänderungen während unserer Manipulation zu überwachen. Damit lassen sich stark räumlich und zeitlich begrenzte Schwankungen des Calciums ^messen37,46. Zur Beurteilung der synaptischen Vesikelfusion und -freisetzung werden reife Neuronen mit Styrylfarbstoff beladen, der in synaptische Vesikelmembranen eingebaut wird, während sie in präsynaptischen Zellen recycelt, reformiert und mit Neurotransmittern wieder geladen werden41,42,43,47,48. Die aktuellen Farbstoffe, die zu diesem Zweck verwendet werden, markieren synaptische Vesikel entlang von Neuriten und werden als Proxy für diese Regionen in Live-Imaging-Experimenten verwendet, wie die gemeinsame Färbung von Styrylfarbstoff und Synaptotagmin durch Kraszewski und Kollegen gezeigt ^wurde49. Hier sind repräsentative Bilder ähnlicher Färbungen enthalten, die ebenfalls durchgeführt wurden (Abbildung 2A). Frühere Forscher haben solche Farbstoffe ausgiebig verwendet, um die Dynamik synaptischer Vesikel an der neuromuskulären Verbindung und den Hippocampus-Neuronen zu melden48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Durch die Auswahl punktueller Regionen von farbstoffbeladenen Vesikeln und durch die Überwachung der Abnahme der Fluoreszenzintensität nach der Vesikelfreisetzung können die funktionelle synaptische Übertragungskapazität und die zeitliche Dynamik der Freisetzung nach Stimulation untersucht ^werden43. Für beide Methoden wird ein Medium verwendet, das eine hohe Konzentration an Kaliumchlorid enthält, um Zellen zu depolarisieren, um neuronale Aktivität nachzuahmen. Bildgebungsparameter werden angegeben, um Intervalle von unter einer Sekunde zu erfassen, die sich über eine Basisnormalisierung erstrecken, gefolgt von unserer Stimulationserfassungsperiode. Fluoreszenzmessungen zu jedem Zeitpunkt werden bestimmt, auf den Hintergrund normalisiert und über den experimentellen Zeitraum quantifiziert. Calcium-Influx-vermittelte GCaMP6m-Fluoreszenzerhöhung oder effektive synaptische Vesikel-Exozytose-Styryl-Farbstofffreisetzungsfluoreszenzabnahme kann durch diese Strategie nachgewiesen werden. Detaillierter methodischer Aufbau und Parameter für diese beiden Protokolle und eine Diskussion über ihre Vorteile und Grenzen werden im Folgenden beschrieben.

Abbildung 1: Visuelles Rendering des allgemeinen Protokollprozesses. (1) Isolieren und kultivieren Sie primäre Nagetierneuronen in vitro zum gewählten Reifungszeitpunkt. (2) Einführung von GCaMP-DNA oder Styrylfarbstoff als Reporter der synaptischen Aktivität. (3) Richten Sie das Bildgebungsparadigma mit einem mit Live-Imaging ausgestatteten Konfokalmikroskop und der zugehörigen Software ein. Beginnen Sie mit dem Baseline-Aufzeichnungszeitraum. (4) Während Zellen noch live aufgenommen werden, stimulieren sie Neuronen durch hohe KCl-Badperfusion. (5) Bewertung von Fluoreszenzintensitätsmessungen im Laufe der Zeit, um Calciumtransienten oder synaptische Vesikelfusion zu messen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Alle in dieser Studie durchgeführten Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Jefferson University genehmigt. 1. Primärkultur von Neuronen aus dem embryonalen Rattenkortex HINWEIS: Primäre kortikale Neuronen werden aus E17.5-Rattenembryonen isoliert, wie zuvor beschrieben57,58. Mit dem Erfolg dieses Kultivierungsprotokolls scheint es keine Dehnungsverzerrung zu geben. Diese M…

Representative Results

Nach der erfolgreichen Implementierung des oben genannten Protokolls werden repräsentative Ergebnisse für ein typisches Synapikelfreisetzungsexperiment mit Styrylfarbstoff gezeigt. Kultivierte kortikale Neuronen von Ratten wurden mit der in Abschnitt 6 beschriebenen Methode mit Farbstoff beladen. Die Spezifität der Farbstoffbelastung wurde durch Co-Markierung mit dem synaptischen Vesikelmarker Synaptophysin bestimmt. Ein Großteil der Styrylfarbstoff-positiven Puncta ist für diesen Marker co-positiv (<strong class="x…

Discussion

Drei Schritte, die beiden beschriebenen Methoden gemeinsam sind, sind von entscheidender Bedeutung für den experimentellen Erfolg und quantifizierbare Ergebnisse. Erstens ist die Vorbereitung von frischem aCSF vor jeder Experimentierrunde unter Einhaltung der beigefügten Anweisungen unerlässlich. Andernfalls kann eine angemessene neuronale Depolarisation verhindert werden. Eine Probe unbehandelter Kontrollneuronen sollte vor der Stimulation von Versuchsgruppen ständig getestet werden, um eine ordnungsgemäße zellul?…

Materials

20x air objective	Nikon		For imaging
40x oil immersion objective	Nikon		For imaging
B27 supplement	Thermo Scientific	17504044	Neuronal growth supplement
BD Syringes without Needle, 50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	Part of gravity perfusion assembly
Biosafety cell culture hood	Baker	SterilGARD III SG403A	Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading
b-Mercaptoethanol	Millipore Sigma	M3148	For culturing and maintenance of neuronal cultures
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418	For preparing neuronal cultures
Calcium chloride dihydrate	Millipore Sigma	223506	Component of aCSF solutions
Cell culture CO2 incubator	Thermo Scientific	13-998-123	For culturing and maintenance of neurons
Centrifuge	Eppendorf	5810R	For neuronal culture preparation
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti +A1R core	For fluorescence imaging
CoolSNAP ES2  CCD camera	Photometrics		For image acquisition
D-Glucose	Millipore Sigma	G8270	Component of aCSF solutions
DNase	Millipore Sigma	D5025	For neuronal culture preparation
Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats	Charles river	400SASSD	For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures
FITC Filter cube	Nikon	77032509	For imaging Gcamp calcium transients
FM4-64 styryl dye	Invitrogen	T13320	For imaging synaptic vesicle release
Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)	CellVis	D35-10-1.5-N	For growth of neurons on imaging-compatible culture dish
Glass Pasteur pipette	Grainger	52NK56	For preparing neuronal cultures
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Millipore Sigma	H6648	For preparing neuronal cultures
HEPES	Millipore Sigma	H3375	Component of aCSF solutions
High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
horse serum	Millipore Sigma	H1138	For culturing and maintenance of neurons
Laminar flow dissection hood	NUAIRE	NU-301-630	For preparing neuronal cultures
Laminin	Thermo Scientific	23017015	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium	Thermo Scientific	11415064	For preparing neuronal cultures
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Thermo Scientific	21083027	For preparing neuronal cultures
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Scientific	25030149	Neuronal culture supplement
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Scientific	11668019	For neuronal transfections
Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)			For imaging. Please see recipes*
Magnesium chloride	Millipore Sigma	208337	Component of aCSF solutions
Microsoft Excel	Microsoft		Software for data analysis/normalization
Nalgene  Filter Units, 0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	Filter unit for aCSF solution
Neurobasal medium	Thermo Scientific	21103049	For culturing and maintenance of neuronal cultures
NIS-Elements Advanced Research	Nikon		Software for image capture and analysis
Nunc 15 mL Conical tubes	Thermo Scientific	339650	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Nunc 50 mL conical tubes	Thermo Scientific	339652	For preparing neuronal culture and buffer solutions
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	For preparing neuronal cultures
Papain	Millipore Sigma	P4762	For preparing neuronal cultures
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Scientific	15140122	To prevent bacterial contamination of neuronal cultures
Perfusion system	Warner Instruments	SF-77B	For exchange of aCSF
Perfusion tubing	Cole-Parmer	UX-30526-14	Part of gravity perfusion assembly
pGP-CMV-Gcamp6m plasmid	Addgene	40754	For imaging calcium transients
Poly-D-lysine hydrobromide	Millipore Sigma	P7886	Coating agent for glass bottom petri dishes
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Component of aCSF solutions
Sodium bicarbonate	Millipore Sigma	S5761	Component of aCSF solutions
Sodium Chloride	Millipore Sigma	S9888	Component of aCSF solutions
Stage Top Incubator	Tokai Hit		For incubation of live neurons during imaging period
TRITC Filter cube	Nikon	77032809	For imaging FM4-64
Trypsin Inhibitor	Millipore Sigma	T6414	For preparing neuronal cultures
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Scientific	25200056	For preparing neuronal cultures
Vibration Isolation table	New Port	VIP320X2430-135520	Table/stand for microscope